β-1,3-1,4-葡聚糖酶活检测试剂盒/48样
测定意义：
β-1,3-1,4-葡聚糖酶（又称地衣多糖酶；EC 3.2.1.73）是一类重要的水解酶，可以水解谷物中的β-1,3-1,4-葡聚糖，其在食品、饲料和纺织等领域的具有重要应用价值。本试剂盒采用对硝基酚-α-鼠李糖苷(PNPR)作为底物，生成黄色的对硝基苯酚（PNP）， 该产物在 405nm 处有大吸收峰。通过检测PNP在405nm下的增加速率，即可得到α-L-鼠李糖苷酶活性的大小。Β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解底物葡聚糖产生还原性糖。利用 3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的量，在 540nm 读取吸光值，进而得出β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL蒸馏水，80℃水浴10min充分容解，冷却至室温待用。 |
试剂三 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿（光径1cm）、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、恒温培养箱、研钵、蒸馏水。
β-1 , 3-1 ,4-葡聚糖酶(β-1 , 3-1 ,4-GA)活性测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入 1mL 提取液，在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注 ：也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30次）；12000rpm，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：也可按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500~1000 ：1的比例进行提取。
③ 若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需 4℃×12000rpm，离心10min，取上清液检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温（25℃),在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 280 | 300 |
试剂二 | 20 | |
37℃孵育30min。 |
试剂三 | 300 | 300 |
混匀,95℃水浴5min,取出后用自来水或冰水冷却至室温,取全部澄清液体至1mL玻璃比色皿（光径1cm）中,在540nm处读取吸光值A,ΔA=A测定管-A对照管(每个样本做一个对照管)。 |
注：若ΔA 在零附近徘徊，可在样本制备时加大取样质量W（如增至 0.5g）,或在上机检测时加大上样量 V1（由100μL增加到200μL，则试剂一相应减少，保持总体积不变），或延长反应时间T（如增至60min）,则改变后的 W、V1 和 T 需带入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0087x - 0.0408 ；x为标准品浓度(μg），y为ΔA。
2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟分解葡聚糖产生1μg 还原性糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087] ÷ (V1×Cpr) ÷T=38.3 × (ΔA+0.0408)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算：
酶活定义 ：
每克组织样本每分钟分解葡聚糖产生 1 μg 还原性糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=38.3 × (ΔA+0.0408)÷W。
4、按细胞数量计算：
酶活定义 :
每1万个细菌或真菌每分钟分解葡聚糖产生1μg还原性糖定义一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min /10⁴cell)=[(ΔA+0.0408)÷ 0.0087] ÷ (500 ×V1 ÷V)÷T=0.08 ×( Δ A+0.0408)。
5、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体中每分钟分解葡聚糖产生1μg 还原性糖定义一个酶活性单位。
Β -1,3-1,4-GA( μg/min/mL)=[( ΔA+0.0408) ÷ 0.0087] ÷ (V1× Cpr)÷ T=38.3 × (ΔA+0.0408 ) ÷CprV---提取液体积,1mL;V1---样本上样 体积,100 μL =0.1mL；T---反应时间,30min； W---样本鲜重，g；500---细菌/真菌总数,500 万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用 本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品（1mg/mL）：从标准品管中称量取出2mg 至一新EP管中，再加2mL蒸馏水混匀溶解即1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据100 μL标准品+300μL 试剂一+300μL 试剂三，混匀95℃水浴5min，取出后用自来水或冰水冷却至室温，取全部澄清液体至1mL 玻璃比色皿（光径1cm）中，在540nm 处读取吸光值 A，根据结果即可制作标准曲线。
