β-1,3-1,4-葡聚糖酶活检测试剂盒/96样
测定意义：
β-1,3-1,4-葡聚糖酶(又称地衣多糖酶；EC 3.2.1.73)是一类重要的水解酶，可以水解谷物 中的β-1,3-1,4-葡聚糖，其在食品、饲料和纺织等领域的具有重要应用价值。β-1,3-1,4-葡聚糖酶水解底物葡聚糖产生还原性糖。利用3,5-二硝基水杨酸测定还原糖的量，在540nm 读取吸光值，进而得出β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性大小。
试剂组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体120mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水，80℃水浴10min充分溶解，冷却至室温待用。 |
试剂三 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、移液器、研钵、冰和蒸馏水。
β-1 , 3-1 ,4-葡聚糖酶(β-1 , 3-1 ,4-GA)活性测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 .1g组织(水分充足的样本可取0.5g) 到研钵内，加入1mL 提取液，在冰上进行 冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可以按照组织质量 (g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌/真菌加入1mL 提取液；冰 浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴，功率20%或200W, 超 声 3s, 间 隔 1 0s, 重 复 3 0 次 ) ; 12000rpm,4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL) 为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：若是澄清液体，直接检测，若液体样本浑浊，需4℃×12000rpm, 离 心 1 0min,取上清液检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至540nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃),在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 140 | 150 |
试剂二 | 10 | 100 |
37℃孵育30min。 |
试剂三 | 150 | 150 |
混匀，95°℃水浴5min,取出后用自来水或冰水冷却至室温，取200μL澄清液体于96孔板中，在540nm处读取吸光值A,△A=A测定管-A对照管(每个样本做一个对照管)。 |
注 : 若△A 在零附近徘徊，可在样本制备时加大取样质量 W(如增至0.5g), 或在上机检测时加大上样量 V1 (由50 μL 增加到100μL, 则试剂一相应减少，保持总体积不变),或延长反应时间 T (如增至60min), 则改变后的 W、V1 和 T 需带入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.0123x-0.035;x为标准品浓度(μg),y为△A。
2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟分解葡聚糖产生1μg 还原性糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min/mg prot)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087] ÷ (V1 ×Cpr)÷T=38.3 ×(ΔA+0.0408)÷Cpr。
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织样本每分钟分解葡聚糖产生1μg还原性糖定义为一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min/g 鲜重)=[(ΔA+0.0408)÷0.0087] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=38.3 × (ΔA+0.0408)÷W。
4、按细菌/真菌数量计算：
酶活定义:
每 1 万个细菌或真菌每分钟分解葡聚糖产生1μg 还原性糖定义一个酶活性单位。
β-1,3-1,4-GA(μg/min /10⁴cell)=[(ΔA+0.0408) ÷ 0.0087] ÷ (500 ×V1 ÷V) ÷T=0.08 × ( Δ A+0.0408)。
5、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体中每分钟分解葡聚糖产生1μg 还原性糖定义一个酶活性单位。
β -1,3-1,4-GA( μ g/min/mL)=[( Δ A+0.0408) ÷ 0.0087] ÷ (V1 × Cpr)÷ T=38.3 × (ΔA+0.0408)÷CprV---提取液体积,1mL; V1---样本上 样体积,100μL =0.1mL；T---反应时间,30min; W---样本鲜重,g；500---细菌/真菌总数，500 万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用 本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品（1mg/mL）：从标准品管中称量取出2mg 至一新EP管中，再加 2mL蒸馏水混匀溶解即 1mg/mL 的葡萄糖（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据100μL标准品+300μL 试剂一+300μL 试剂三，混匀 95℃水浴 5min，取出后用自来水或冰水冷却至室温，取全部澄清液体至 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）中，在 540nm 处读取吸光值 A，根据结果即可制作标准曲线。
