普鲁兰酶活性检测试剂盒/48样
测定意义：
普鲁兰酶是一种水解酶，广泛存在于微生物及动物、植物体内，能专一地分解淀粉和糖原及其衍生物分枝点的α-1.6-葡萄糖昔键。它的这种特性早被用于淀粉结构的理论研究，到七十年代，普鲁兰酶的应用已扩展到淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域，并逐步从实验室阶段走向工业化规模。普鲁兰酶催化普鲁兰分解产生还原糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，经光谱扫描在540nm 有特征光吸收，在一定范围内540nm 光吸收值与还 原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算普鲁兰酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部，再加入12mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存。 |
试剂三 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、低温离心机、水浴锅、可调式移液 器、研钵、冰和蒸馏水。
普鲁兰酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入1mL 提取液，在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注 ：若增加样本量,也可以按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取。
② 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20(95℃煮沸10min的酶液) |
试剂二 | 100 | 75 |
混匀，50℃孵育30min。 |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀，95℃水浴10min(用封口膜缠紧，以防止水分散失),流水冷却至室温。 |
蒸馏水 | 500 | 500 |
混匀，全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，于540nm 处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本做 一 个自身对照)。 |
注：
1、若 A 测定管的吸光值大于2,可以用蒸馏水对整个显色混合液用蒸馏水进行稀释(如取显色混合液360 μL 至 1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中，再加360 μL 蒸馏水，即稀释2倍),则稀释倍数 D 需代入公式计算。或减少上清液体积 V1 (如减至10μL,则加10 μL 蒸馏水补齐),则 V1 需代入公式重新计算。
2、若△A 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积V1 (如增至40μL, 则后蒸馏水体积相应减少，保持反应总体积不变),或延长50℃孵育时间 T (如增至60min), 则相应的 V1和反应时间 T 需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=13.144x-0.0644;x 为标准品质量 (mg),y为△A。
2、按蛋白浓度计算：
单位定义：
37℃每毫克蛋白每分钟产生1 μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min /mgprot)=[(△A+0.0644)÷13.144×103]÷(V1×Cpr)÷T=126.8×(△A+0.0644)÷Cpr
3、按鲜重计算：
单位定义：
37℃每克组织每分钟产生1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min/g鲜重)=[(△A+0.0644)÷13.144×103]÷(W×V1÷V2)÷T=126.8×(△A+0.0644)÷W
4、按液体样本计算：
单位定义：
37℃每毫升液体样本每分钟产生1 μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min /mL液体)=[(△A+0.0644)÷13.144×103]÷V1÷T =126.8×(△A+0.0644)V--- 加入提取液体积，1mL;V1---加入反应体系 中样本体积，0.02mL;T--- 反应时间，30min;W--- 样本鲜重，g;Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的蛋白含量(考马斯亮蓝法)试 剂盒,不建议使用蛋白含量(BCA法)试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制1. 制备标准品母液(5mg/mL): 向标准品 EP 管里面加入1mL 蒸馏水(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,1,2,3,4,5.mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照：20μL 标准品+100 μL 蒸馏水+100 μL 试剂三，95℃水浴10min, 冷却后，再加500 μL 蒸馏水，混匀，全部液体转移至1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中，540nm 下测定，根据结果即可制作标准曲线。
