普鲁兰酶活性检测试剂盒/ 96样
测定意义：
普鲁兰酶是一种水解酶，广泛存在于微生物及动物、植物体内，能专一地分解淀粉和糖原及其衍生物分枝点的α-1.6-葡萄糖昔键。它的这种特性早被用于淀粉结构的理论研究，到七十年代，普鲁兰酶的应用已扩展到淀粉糖浆、啤酒和酒精生产等多个淀粉深加工领域，并逐步从实验室阶段走向工业化规模。普鲁兰酶催化普鲁兰分解产生还原糖，进一步与3,5-二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化合物，经光谱扫描在540nm 有特征光吸收，在一定范围内540nm 光吸收值与还原糖生成量成正比。通过光吸收增加速率来计算普鲁兰酶活性大小。
试剂组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部，再加入22mL试剂一充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存； |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
普鲁兰酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 .1g组织(水分充足的样本可取0.5g)到研钵内，加入1mL提取液，在冰上进行 冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃离心1 0min, 取上清，置冰上待测。
注 : 也可以按照组织质量 (g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 液体样本：直接测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至540nm。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20(95℃煮沸10min的酶液) |
试剂二 | 100 | 100 |
混匀,50℃孵育30min |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀，95℃水浴10min(用封口膜缠紧，以防止水分散失),流水冷却至室温。 |
蒸馏水 | 500 | 500 |
混匀,取出200μL至96孔板中,于540nm处读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
注 :
1、若 A 测定管的吸光值大于2,可以用蒸馏水对整个显色混合液用蒸馏水进行稀释(如取显色混合液100 μL 至96孔板中，再加100 μL 蒸馏水，即稀释2倍),则稀释倍数 D 需代入公式计算。或减少上清液体积 V1 (如减至10μL, 则加10 μL 蒸馏水补齐),则 V1 需代入公式重新计算。
2、若△A 值在零附近徘徊，可增加样本加样体积 V1 (如增至40μL, 则后蒸馏水体积相应减少，保持反应总体积不变),或延长50℃孵育时间 T (如增至60min), 则相应的 V1和反应时间 T 需代入公式重新计算。△A 在零附近徘徊，可在样本制备时加大取样质量 W(如增至0.5g), 或在上机检测时加大上样量 V1 (由50 μL 增加到100μL, 则试剂一相应减少，保持总体积不变),或延长反应时间 T (如增至60min), 则改变后的 W、V1和T 需带入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=8.154x-0.0438;x为标准品质量 (mg),y为△A。
2、按蛋白浓度计算：
单位定义：
37℃每毫克蛋白每分钟产生1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min/mgprot)=[(△A+0.0438)÷8.154×103]÷(V1×Cpr)÷T=204.4×(△A+0.0438)÷Cpr
3、按鲜重计算：
单位定义：
37℃每克组织每分钟产生1 μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min/g鲜重)=[(△A+0.0438)÷8.154×103]÷(W×V1÷V2)÷T =204.4×(△A+0.0438)÷W
4、按液体样本计算：
单位定义：
37℃每毫升液体样本每分钟产生1 μg 还原糖定义为一个酶活性单位。
普鲁兰酶活性(μg/min/mL液体)=[(△A+0.0438)÷8.154×103]÷W×V1÷T=204.4×(△A+0.0438)V---加入提取液体积,1mL;V1---加入反应体系中 样本体积，0.02mL;T--- 反应时间，30min;W--- 样本鲜重，g;Cpr--- 样本蛋白质浓度,mg/mL; 建议使用本公司的蛋白含量(考马斯亮蓝法)试剂 盒，不建议使用蛋白含量(BCA 法)试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5mg/mL): 向标准品 EP 管里面加入1mL 蒸馏水(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,1,2,3,4,5.mg/mL。 也可根据实际样本来调 整标准品浓度。
3、按照：20μL 标准品+100 μL 蒸馏水+100 μL 试剂三，95℃水浴10min, 冷却后，再加500μL 蒸馏水，混匀，取200μL 至96孔板中，540nm下测定，根据结果即可制作标准曲线。
