几丁质外切酶检测试剂盒/24样

几丁质外切酶检测试剂盒/24样

测定意义： 

多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶，高等植物本身不存在作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到病原菌感染时，几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与 植物对病原微生物的抗性有关，是重要的病程相关蛋白。几丁质酶主要水解几丁质多聚体中β-1,4-糖苷键。依据水解位置的不同可分为几丁质内切酶和几丁质外切酶，几丁质外切酶作用于几丁质后，生成 N- 乙酰氨基葡萄糖单体， 进一步与铁氰化钾反应，于420nm 处检测，进而计算得到几丁质外切酶活性大小。

试剂盒组成和配制：

所需的仪器和用品：

可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、天平、水浴锅、低温离心机、盐酸。

普鲁兰酶活性测定：

建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!

1、样本制备：

① 组织样本：称取约0 . 1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆，于4℃,12000rpm 离心10min, 取上清置冰上待测。

② 真菌样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细胞(功率300w,  超声3秒，间隔7秒，总时间3min);于 4 ℃ , 12000rpm离心 10min, 取上清置于冰上待测。

注: 若增加样本量，可按照提取液 (mL): 细细胞数量(10⁴)为1:500~1000的比例进行提取。

2、上机检测：

① 可见分光光度计预热 30min 以上，调节波长至420nm，蒸馏水调零。

② 在EP管中依次加入：

③ 在EP管中依次加入：

④ 在 EP 管中依次加入：

注：

1、煮沸的样本：于95-100℃煮沸10min, 使样本里面的酶失去活性。

2、若△A 较小，可以加大样本量(如增至140μL, 则试剂一相应减少),或增加样本取样量(如0 .2g),则改变后的V1 和样本 W 需代入公式重新计算。

结果计算：

1、标准曲线方程：

      y=0.0248x+0.0024,X 是标准品质量(μg),y是△A。

2、按照样本重量计算：

      定义：

      每克组织每小时分解几丁质产生1μgN- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。

      几丁质外切酶活性(μg/h/g鲜重)=[(△A-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×W)÷T=439.1×(△A-0.0024)÷W

3、按照蛋白质浓度计算：

      定义：

      每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1μgN- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。 

      几丁质外切酶活性(μg/h/mg prot)=[(△A-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1×Cpr)T=439.1×(△A-0.0024)÷Cpr

4、按细胞数量计算：

      定义：

      每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。

      几丁质外切酶活性(μg/h/10⁴cell)=[(△A-0.0024)÷0.0248×1.96]÷(V1÷V×细胞数量)=439.1×(△A-0.0024)÷细胞数量V---加入提取液体积，            1mL;V1--- 样本体积，0.12mL;T--- 反应时间，1.5h;1.96---体积系数；W--- 样本质量，g;标准品分子量---221.21;Cpr--- 样本蛋白浓度，              mg/mL, 建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒

附：标准曲线制作过程：

1、制备标准品母液(1mg/mL):  标准品临用前加2mL 蒸馏水，即为1mg/mL。

2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1mg/mL。

3、依据第④步骤的加样体系：360 μL 标准品+480 μL 试剂六，混匀，95-100℃煮沸10min,  取全部液体至1mL比色皿中于420nm 处读取各管吸光值 A,标准品的质量作为横坐标，0mg/mL 对应的 A 值减去各浓度标准品对应的 A 之差作为纵坐标，即可得出标准曲线。