几丁质外切酶检测试剂盒/48样
测定意义：
多种微生物、动物、植物等都可产生几丁质酶，高等植物本身不存在作为真菌细胞壁组分之一的几丁质，但当植物受到病原菌感染时，几丁质酶活性迅速提高。因此该酶与植物对病原微生物的抗性有关，是重要的病程相关蛋白。几丁质酶主要水解几丁质多聚体中β-1,4-糖苷键。依据水解位置的不同可分为几丁质内切酶和几丁质外切酶，几丁质外切酶作用于几丁质后，生成 N- 乙酰氨基葡萄糖单体，进一步与铁氰化钾反应，于420nm 处检测，进而计算得到几丁质外切酶活性大小。
试剂组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | ④℃保存 | |
试剂一 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉体落入底部,再加5mL盐酸充分混匀溶解后,再加5.5mL蒸馏水混匀用。 |
试剂三 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉剂g×1瓶 | | 临用前甩几下使粉体落入底部，再加24mL蒸馏水溶解备用。 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、9 6孔 板、天平、水浴锅、低温离心机、盐 酸、 蒸馏水。
几丁质外切酶活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本： 称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆，于4℃,12000rpm 离心10min, 取上清置冰上待测。
注 : 若增加样本量，可按照提取液体积(mL): 组织质量(g)为1:5~10的比例进行提取。
② 真菌样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细胞加入1mL 提取液； 冰浴超声波破碎细胞(功率300w, 超声3秒，间隔7秒，总时间3min); 于 4 ℃ , 12000rpm离心10min, 取上清置于冰上待测。
注 : 若增加样本量，可按照提取液 (mL):细细胞数量(10⁴)为1:500~1000的比 例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至420nm。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 80 | |
煮沸的样本 | | 80 |
试剂一 | 80 | 80 |
试剂二 | 100 | 100 |
混匀，37℃(恒温培养箱)孵育1.5h后，4000rpm离心5min,取上清 |
③ 在EP管中依次加入：
④ 在 EP 管中依次加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂四 | 200 | 200 |
混匀，95- 100℃煮沸8min,取200μL至96孔板中于420nm处取 各管吸光值A,△A=A对照-A测定(每个样本做一个自身对照)。 |
注 :
1、煮沸的样本：于95-100℃煮沸10min, 使样本里面的酶失去活性。
2、若△A 较小，可以加大样本量(如增至120μL,则试剂一相应减少),或增加样本取样
量(如至0.2g),则改变后的 V1 和样本质量 W需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.0417x+0.0005,X是标准品质量(μg),y是△A。
2、按照样本重量计算：
定义：
每克组织每小时分解几丁质产生1μgN- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。
几丁质外切酶(μg/h/g鲜重)=[(△A-0.0005)÷0.0417×2.23]÷(V1÷V×W)÷T=445.6×(△A-0.0005)÷W
3、按照蛋白质浓度计算：
定义:
每毫克蛋白每小时分解几丁质产生1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。
几丁质外切酶(μg/h/mgprot)=[(△A-0.0005)÷0.0417×2.23]÷(V1×Cpr)T=445.6×(△A-0.0005)÷Cpr
4、按细胞数量计算：
定义：
每10⁴个细胞每小时分解几丁质产生1μgN-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个单位。
几丁质外切酶(μg/h/10⁴ cell)=[(△A-0.0005)÷0.0417×2.23]÷(V1÷V×细胞量)=445.6 ×(△A-0.0005)÷细胞数量V--- 提取液体积，1mL; V1--- 样本体积，0.08mL;T---反应时间，1.5h;W---样本质量，g; 2.23---体积系数；标准品分子量---221.21;Cpr--- 样本蛋白浓度，mg/mL, 建议使 用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(1mg/mL):标准品临用前加2mL蒸馏水，即为1mg/mL.
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1mg/mL。
3、依据第④步骤的加样体系：150μL 标准品+200 μL 试剂六，混匀，95-100℃煮沸8min,取200μL至96孔板中于420nm处读取各管吸光值 A, 标准品的质量作为横坐标，0mg/mL对应的A值减去各浓度标准品对应的 A 之差作为纵坐标，即可得出标准曲线。
