山梨醇氧化酶(SOX)检测试剂盒/48样
测定意义：
山梨醇作为一种运输糖，被卸载到果实中时转化成其他糖类物质，山梨醇氧化酶(sorbitoloxidase,SOX) 就是山梨醇转化和利用过程中的关键酶之一，该酶与果实的品质以及果实中糖类物质的积累密切相关。山梨醇氧化酶 (SOX) 催化山梨醇生成葡萄糖，葡萄糖进一步与3,5-二硝基水杨酸反应， 生成棕红色氨基化合物，经光谱扫描在540nm 有特征光吸
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | ④℃保存 | |
试剂一 | 粉体7mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 用前加入2.5mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂4℃保存； |
试剂三 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
山梨醇氧化酶(SOX)活性测定
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
称样本0.1g (水分充足的样本可取0.5g) 于研钵中，加入1mL 提取液，冰浴匀浆后转 入离心管中。12000rpm,4℃ 离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至540nm。
② 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 20 | 20 |
试剂一 | 60 | 60 |
试剂二 | 20 | 20 |
混匀，30°℃(水浴锅或恒温培养箱)下孵育30min |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀，沸水浴(95-100℃)(可用封口膜缠紧EP管)5min,流水冷却 |
蒸馏水 | 200 | 200 |
混匀, 取出200μL至96孔板 中,于 5 4 0 n m 处 读 取 吸 光 值 A ,△A=A测定 - A对照(每个样本自身需做 一 个自身对照)。 |
注 :
1、若吸光值大于1.8,可减少样本加样量 V1 (如减至10μL, 则试剂一相应增加), 则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
2、若△A 值在零附近徘徊，可延长30℃水浴时间(如增至60min), 则改变后的反应时间T需代入公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.0125x-0.0338;x为标准品质量(μg),y为△A。
2、按蛋白浓度计算：
单位定义：
37℃每毫克蛋白每分钟产生1 μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。
山梨醇氧化酶 (SOX)(μg/min/mgprot)=[(△A+0.0338)÷0.0125]÷(V1×Cpr)÷T =133.3×(△A+0.0338)÷Cpr
3、按鲜重计算：
单位的定义：
37℃每克组织每分钟产生1μg 葡萄糖定义为一个酶活性单位。
山梨醇氧化酶 (SOX)(μg/min/g鲜重)=[(△A+0.0338)÷0.0125]÷(W×V1÷V)÷T =133.3×(△A+0.0338)÷WV----加入提取液体积,1mL;V1----加 入反应体系中样本体积，0.02mL;T-----反应时间，30min;W---- 样本鲜重，g;Cpr---- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的BCA蛋白含 量检测试剂盒；
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5mg/mL): 向标准品EP管里面加入1mL蒸馏水(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,1,2,3,4,5.mg/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照测定管的加样顺序依次加样操作，根据结果即可制作标准曲线。
