6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)/醛糖6-磷酸还原酶(A6PR)检测试剂盒/48样
测定意义：
6-磷酸山梨醇脱氢酶 (S6PDH,EC 1.1.1.200)又称醛糖6-磷酸还原酶(Aldose-6-phos-phate reductase,A6PR),催化 D-山梨糖醇6-磷酸和 D-葡萄糖6-磷酸之间的相互转化。研究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布，其在山梨醇合成中起着重要作用。6-磷酸山梨醇脱氢酶 (S6PDH)催化 D- 葡萄糖6-磷酸还原，并使还原型辅酶Ⅱ(NADPH)氧化。因此，通过检测340nm下NADPH的下降速率，即可得出 S6PDH的酶活性大小。该酶催化的反应 :D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose6-phosphate+NADPH+H+。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×2支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分别加0.6mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,三天内用完。 |
试剂二 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL石英比色皿(光径1cm)、 台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 研钵、冰。
6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0 . 1g 组织样本，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm,4℃ 离 心 1 0min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
2、上机检测：
① 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在1mL 石英比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 40 |
试剂一 | 20 |
试剂二 | 680 |
混匀，室温(25℃)下孵育10min剂二 |
试剂三 | 20 |
混匀，室温(25℃)下，于340nm处读取A1,10min后读取A2。△A=A1-A2 |
注：
1、若1 0s后反应体系未稳定可延长到1min 再读值。
2、若△A 在零附近，可适当延长反应时间 T 至 2 0min 或更长读取 A2, 或适当加大样本 量 V1 (如增至60μL, 则试剂二相应减少),则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若起始值 A1 太大如超过2(如颜色较深的植物叶片， 一般色素较高，则起始值相对会偏高),可以适当减少样本加样量 V1, 则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 上清液用于检测
4. 若△A 大于0.3,需减少反应时间 T (如减至5min), 则改变后的 T 需代入公式重新 计算。
5、若下降趋势不稳定，可以每隔30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmolNADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH活力(nmol/min/mgprot)=[△A×V2÷(E×d)×10°]÷(V1×Cpr)÷T=305.5×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织在每分钟内氧化1nmolNADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/g鲜重)=[△A×V2÷(ε×d)×109]÷(W×V1÷V)÷T=305.5×△A÷WV---加入提取液体积，1mL;V¹--- 加入样本体积， 0.04mL;V2--- 反应体系总体积，7.6×10-4L;d--- 光径，1cm;S---NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm;W-- -样本质量，g; T--- 反应时 间,10min;Cpr--- 蛋白浓度 (mg/mL), 建议使用本公司的BCA蛋白含量测定试剂盒。
