6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)/醛糖6-磷酸还原酶(A6PR)检测试剂盒/96样
测定意义：
6-磷酸山梨醇脱氢酶（ S6PDH ，EC 1.1.1.200）又称醛糖 6-磷酸还原酶（Aldose-6-phos -phate reductase ，A6PR） ，催化 D-山梨糖醇 6-磷酸和 D-葡萄糖 6-磷酸之间的相互转化。研究发现该酶在苹果叶片等蔷薇科植物中广泛分布，其在山梨醇合成中起着重要作用。
6- 磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)催化D-葡萄糖 6-磷酸还原, 并使还原型辅酶Ⅱ（NADPH）氧化。因此，通过检测340nm下NADPH的下降速率，即可得出S6PDH的酶活性大小。该酶催化的反应： D-sorbitol 6-phosphate+NADP+=D-glucose 6-phosphate+NADPH+H+
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂 mg×2 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分别加0.6mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,三天内用完。 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
6-磷酸山梨醇脱氢酶(S6PDH)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g 组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。
② 所有试剂解冻至室温（25℃)。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 10 |
试剂一 | 10 |
试剂二 | 170 |
混匀，室温(25℃)下孵育10min剂二 |
试剂三 | 10 |
混匀，室温(25℃)下，于340nm处读取A1,10min后读取A2。△A=A1-A2 |
注 :
1、若10s 后反应体系未稳定可延长到1min再读值。
2、若△A 在零附近，可适当延长反应时间 T 至 20min 或更长读取 A2，或适当加大样本量V1（如增至 20 μL，则试剂二相应减少），则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若起始值 A1 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高），可以适当减少样本加样量 V1，则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。
或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后12000rpm, 4℃离心10min，上清液用于检测；
4、若ΔA 大于 0.25，需减少反应时间 T(如减至5min)，则改变后的 T 需代入公式重新计算。
5、若下降趋势不稳定，可以每隔 30S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V2÷(ε×d) ×10⁹]÷(V1×Cpr)÷T=643.1 ×ΔA÷Cpr。
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织在每分钟内氧化1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。
S6PDH 活力(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)×10⁹]÷(W ×V1÷V)÷T=643.1×ΔA÷WV---加入提取液体积,1mL；V1---加入样本体积， 0.01mL；V2---反应体系总体积，2 × 10-4L； d---96 孔板光径，0.5cm；ε---NADPH 摩尔消光系数，6.22 ×10³L / mol /cm；W---样本质 量，g；T---反应时间,10min；Cpr---蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的BCA蛋白含量测定试剂盒。
