乙酰酯酶(AE)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
乙酰酯酶 (EC3.1.1.6,AE) 已被证明是消除饲料细胞壁中阿魏酸等酚酸类木质素的关键酶。可与其他细胞壁降解酶协同作用共同促进饲料等细胞壁的降解。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×2支 | 4℃保存 | 临用前每支加0.7mL无水乙醇混匀溶解，仍4℃保存。 |
试剂三 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体×1支 | | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、 研钵、冰。
乙酰酯酶(AE)活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 . 1g 组织(水分充足的样本可取0.5g),加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，4℃× 12000rpm离心1 5min, 取上清液待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超声3s, 间隔10s, 重复30次);12000rpm4℃离心10min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液 (mL) 为 5 0 0 ~ 1 0 0 0 : 1 的比例进行提取。
③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30 min, 调节波长为405nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂于25℃水浴中预热10 min。
③ 在EP管中依次加入下列试剂：外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm, 蒸馏水调零。
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 460 | 500 |
试剂二 | 40 | |
混匀，40℃孵育30min。 |
试剂三 | 100 | |
混匀，取全部上清液至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中(若有浑浊可8000rpm离心5min后取上清),于405nm读取A值，△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
注：
① 若△A 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1 (如增至200μL, 则试剂一相应减少)或延长反应时间 T(如增至60min 或更长),则重新调整的 V1 和 T 代入公式重新计算。
② 若△A的值超过1,则需要稀释样本，稀释倍数D代入计算公式。
结果计算：
1、标准曲线：
y=0.0259x-0.0031,x 是PNP摩尔质量 (nmol);y是△A。
2、按照样本质量计算：
酶活定义：
每克组织每分钟水解底物产生1nmolPNP定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/g鲜重)=[(△A+0.0031)÷0.0259]÷(W×V1÷V)÷T×D=12.9×(△A+0.0031)÷W×D。
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每分钟水解底物产生1nmolPNP 定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/mgprot)=[(△A+0.0031)÷0.0259]÷(Cpr×V1)÷T×D=12.9×(△A+0.0031)÷Cpr×D。
4、按细菌/细胞数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每分钟水解底物产生1nmolPNP 定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/10⁴cell)=[(△A+0.0031)÷0.0259]÷(500×V1÷V)÷T×D=0.03×(△A+0.0031)×D。
5、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟水解底物产生1nmolPNP定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/mL)=[(△A+0.0031)÷0.0259]÷V1÷T=12.9×(△A+0.0031)W--- 样品质量，g;V--- 提取液体积，1 mL;V1---上清液体积 (mL),0.1mL;T---反应时间，30 minZD---稀释倍数，未稀释即为1;500---细胞数量，万；Cpr---- 上清液蛋白质浓度，mg/mL;建议使用本公司的 BCA蛋白质含量测定试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL): 向标准品EP管里面加入1.4ml 蒸馏水超声溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.04,0.08,0.12,0.16,0.2 μmol/ml。也可根
据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
