乙酰酯酶(AE)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
乙酰酯酶（EC 3.1.1.6，AE）已被证明是消除饲料细胞壁中阿魏酸等酚酸类木质素的关键酶。可与其他细胞壁降解酶协同作用共同促进饲料等细胞壁的降解。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×2支 | 4℃保存 | 临用前每支加0.6mL无水乙醇混匀溶解,仍4℃保存 |
试剂三 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
酶标仪96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、蒸馏水。
乙酰酯酶(AE)活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.1g 组织（水分充足的样本可取0.5g），加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，4℃× 12000rpm 离心15min，取上清液待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声3s，间隔 10s，重复30次）；12000rpm4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴）：提取液（mL）为500~1000：1的
比例进行提取。
③ 液体样本：可直接测定，或者适当稀释后测定。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。
② 所有试剂于 25℃水浴中预热10 min。
③ 在EP管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
试剂一 | 220 | 240 |
试剂二 | 20 | |
混匀，40℃孵育30min。 |
试剂三 | 60 | 60 |
混匀,取200μL上清液至96孔板 中(若 有 浑 浊 可8000rpm离 心5min后取上清),405nm读取A值,Δ A = A测定- A对 照(每个样本做一个自身对照 )。 |
注 :
① 若ΔA 的值非常低在零附近，可增加样本量 V1（如增至150 μL，则试剂一相应减少）或延长反应时间 T（如增至 60min 或更长），则重新调整的 V1 和 T 代入公式重新计算。
② 若△A 的值超过1，则需要稀释样本，稀释倍数D 代入计算公式；
结果计算：
1、标准曲线：
y= 0.0249x - 0.0042，x是PNP 摩尔质量（nmol）；y是△A。
2、按照样本质量计算：
酶活定义：
每克组织每分钟水解底物产生1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE (nmol/min/g 鲜重)=[(△A+0.0042) ÷0.0249] ÷ (W ×V1÷V) ÷T ×D=13.4 ×(△A+0.0042)÷W × D
3、按照样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每分钟水解底物产生1nmol PNP定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/mgprot)=[(△A+0.0042)÷ 0.0249] ÷ (Cpr ×V1)÷ T×D =13.4 × (△ A+0.0042) ÷Cpr ×D
4、按细菌/细胞数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每分钟水解底物产生1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE (nmol/min/10⁴cell)=[(△A+0.0042) ÷0.0249] ÷ (500 ×V1÷V)÷T × D =0.03 ×(ΔA+0.0042)×D
5、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟水解底物产生1nmol PNP 定义为一个酶活单位。
AE(nmol/min/mL)=[(△A+0.0042) ÷0.0499] ÷V1÷T=13.4 × (△A+0.0042)W---样品质量，g；V---提取液体积,1 mL；V1---上清液体积 (mL),0.1mLT---反应时间,30min。 D---稀释倍数，未稀释即为1；500---细胞数量，万；Cpr---上清液蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的 BCA蛋白质含量测定试剂盒
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（10μmol/mL）：向标准品EP管里面加入1.4ml蒸馏水超声溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.04, 0.08, 0.12, 0.16, 0.2μmol/ml。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据对照管的加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
