α-甘露糖苷酶(α-Mannosidase,α-Man)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
乙α-甘露糖苷酶 (EC 3.2.1.24,α-Man)是参与植物体内 N-聚糖加工的关键酶之一。是植物 细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在分生组织的生长、果实的成熟软化、种子的 萌发等生理进程中起重要作用。α-甘露糖苷酶(α-Man) 催化对硝基苯酚-α-D-毗喃甘露 糖苷产生对硝基苯酚 (PNP), 该产物在405nm 处有特征吸收峰，通过测定405nm 光 吸收增加速率，即可计算α-甘露糖苷酶活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水超声溶解备用。 |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、可调式移液器、低温离心机、天平、 研钵、冰和蒸馏水。
α -甘露糖苷酶(a-Man)活性测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.1g 组织(水分充足的样本可取0.5g), 加 入 1mL 提取液，进行冰 浴匀浆。12000rpm,4℃离心10min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10比例提取。
② 细菌或细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞，加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W, 超 声 3s, 间 隔 1 0s, 重 复30次);12000rpm,4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例提取。
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min, 调节波长至405nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 30 | 30 |
试剂一 | 40 | |
试剂二 | 300 | 340 |
迅速混匀，37℃保温30min。 |
试剂三 | 350 | 350 |
混匀，5min后吸取全部澄清液体至1mL玻璃比色皿(光径1cm)中，立即于405nm下读取吸光值A,△A=A测定-A对照(每个测定管需设一个对照管) |
注：若△A 在零附近,可增加样本加样体积 V1(即加样量增加至60μL, 则试剂二相应减少),或延长保温时间 T (如：由30min 延长至60min 或更长),重新调整的 V1和 T 需代入计算公式重新计算。B若A 测定值大于1.5,可对样本上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数 D 代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线：
y=0.0158x-0.0018;x 为标准品摩尔质量 (nmol),y为△A。
2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每分钟催化产生1 nmol对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mgprot)=(△A+0.0018)÷0.0158÷(V1×Cpr)÷T×D 70.3×(△A+0.0018)÷Cpr×D。
3、 按样本质量计算：
酶活定义：
在40℃下,每毫克蛋白每小时水解1μmoLPNPP产生PNP定义为1个酶活单位。
α-L-鼠李糖苷酶(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0022)÷21.604]÷(Cpr×V1)÷T×D=3.47×(△A+0.0022)÷Cpr×D。
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每分钟催化产生1 nmol对硝基苯酚(PNP)为一酶活单位。
Α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/10⁴cell)=(△A+0.0018)÷0.0158÷(V1÷V×细胞数量)÷T×D=70.3×(△A+0.0018)÷ 细胞数量×D。
5、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟催化产生1 nmol对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)=(△A+0.0018)÷0.0158÷V1÷T×D=70.3×(△A+0.0018)×DV---加入提取液体积,1mL;V¹---加入反应体系中 样本体积，30μL=0.03mL;W--- 样本质量，g;500---细胞或细菌总数，500万；T--- 反应时间，30min;D---稀释倍数，未稀释即为1;Cpr--- 样本 蛋白质浓度，mg/mL, 建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒；试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL): 向标准品 EP 管里面加入1mL蒸馏水。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.4,0.8,1.2,1.6,2μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、在 EP 管中依次加入：30 μL 标准品+340 μL 试剂二+350μL 试剂三，混匀转移全部液 体 至 1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中，于405nm下读取吸光值，根据结果制作标准曲线。
