α-甘露糖苷酶(α-Mannosidase,α-Man)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
α-甘露糖苷酶（EC 3.2.1.24,α-Man）是参与植物体内 N-聚糖加工的关键酶之一。是植物细胞壁糖蛋白代谢过程中的关键性糖苷酶，在分生组织的生长、果实的成熟软化、种子的萌发等生理进程中起重要作用。Α-甘露糖苷酶(α-Man)催化对硝基苯酚-α-D-吡喃甘露糖苷产生对硝基苯酚(PNP)，该产物在 405nm 处有特征吸收峰，通过测定 405nm 光吸收增加速率，即可计算α-甘露糖苷酶活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 1.1mL蒸馏水超声溶解备用。 |
试剂二 | 液体10mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体10mL×1支 | | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若要重新做标曲则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪 、96孔 板、可调式移液器、低温离心机、天平、研钵、冰和蒸馏水。
α-甘露糖苷酶(α-Man)活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.1g组织(水分充足的样本可取0.5g)，加入1mL提取液， 进行冰浴匀浆。 12000rpm , 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超声3s,间 隔10s,重复30次);12000rpm4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(10⁴):提取液 (mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min，调节波长至 405nm。
② 所有试剂解冻至室温（25℃)在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 10 | 10 |
试剂一 | 20 | |
试剂二 | 70 | 90 |
迅速混匀，37℃保温20min |
试剂三 | 100 | 100 |
混匀,5min后立即于405nm下读取吸光值A，ΔA=A 测定-A对照(每个测定管需设一个对照管)。 |
注 :
1、若ΔA 在零附近，可增加样本加样体积 V1（即加样量增加至 40μL，则试剂二相应减少），或延长保温时间 T（如：由 30min 延长至 60min 或更长），重新调整的 V1和 T 需代入计算公式重新计算。
2、若A测定值大于1.5，可对样本上清液用蒸馏水稀释，则稀释倍数D代入公式计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.0425x + 0.0039；x为标准品摩尔质量(nmol)，y为ΔA。
2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每分钟催化产生1 nmol 对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mgprot)=(ΔA-0.0039)÷0.0425 ÷(V1×Cpr) ÷T× D=78.43×(ΔA0.0039)÷Cpr×D
3、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每分钟催化产生1 nmol 对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/g鲜重)=(ΔA-0.0039)÷0.0425÷(V1÷V ×W) ÷T× D=78.43 ×(ΔA0.0039)÷W×D
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
每104个细胞每分钟催化产生1 nmol 对硝基苯酚(PNP)为一酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/10⁴cell)=(ΔA-0.0039)÷0.0425 ÷(V1 ÷V×细胞数量)÷T×D=78.43 ×(ΔA-0.0039)÷细胞数量×D
5、按照液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟催化产生1 nmol对硝基苯酚(PNP)为一个酶活单位。
α-甘露糖苷酶活性(nmol/min/mL)= (ΔA-0.0039)÷0.0425 ÷V1÷T × D=78.43 × (ΔA-0.0039) × DV---加入提取液体积,1mL；V1---加入反应 体系中样本体积,10μL=0.01mL；W---样本质量,g；500---细胞或细菌总数，500 万；T---反应时间，30min；D---稀释倍数，未稀释即为1； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL)：向标准品EP管里面加入1mL蒸馏水。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.4, 0.8, 1.2, 1.6, 2 μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、在96孔板中依次加入：10μL 标准品+90μL 试剂二+100μL 试剂三，混匀于 405nm下读取吸光值，根据结果制作标准曲线。
