Ca2+—ATP酶检测试剂盒/24样
测定意义：
Ca²+是细胞内重要的信号分子，细胞质基质始终维持在一个较低水平的Ca²+浓度，Ca²+浓度的维持主要由Ca²+-ATP 酶来维持，该酶可催化ATP水解生成 ADP和无机磷。通过测定无机磷的量来确定该酶活性高低。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加8mL提取液，混匀溶解备用。 |
试剂二 | 粉体×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加15mL提取液，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体4mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前试剂A中加2.9mL的B液，再加37.1mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
| B:液体3mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
注 : 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿（光径1cm）、水浴锅、可调式移液器、研钵和蒸馏水。
Ca²+ATP酶活性检测：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0 . 1g 组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm离心10min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/真菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超 声 3s, 间隔10s,重复3次);12000rpm 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至700nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 120 | |
提取液 | | 200 |
样本 | 200 | |
试剂二 | 200 | 200 |
| | |
37℃孵育20min |
试剂三 | 80 | 80 |
样本 | | 200 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测。匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测。 |
④ 显色反应：
上清液 | 150 | 150 |
试剂四 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.8474x-0.0164,x是标准品摩尔质量(μmol/mL),y是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产 生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T=12.04×(△A+0.0164)÷Cpr
3、 按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W×V1÷V)÷T=12.04×(△A+0.0164)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每小时每1 万个细菌或细胞分解 ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024× (△A+0.0164)
5、液体中 Ca²+-ATPase活力计算：
定义：
每小时每毫升液体分解 ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷V1÷T=12.04×(△A+0.0164)V---加入提取液体积，1mL;V1---加入样本体积，0.2mL;V2--- 酶促反应总体积，0.68mL;T---反应时间，1/3小时；W--- 样本鲜重，g;500---细菌或细胞总数,万 ；Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用 本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmol/mL): 标准品用10mL试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
