Ca2+—ATP酶检测试剂盒/48样
测定意义：
Ca2+ 是细胞内重要的信号分子，细胞质基质始终维持在一个较低水平的 Ca2+ 浓度，Ca2+浓度的维持主要由 Ca2+-ATP 酶来维持，该酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。通过测定无机磷的量来确定该酶活性高低。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体80mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加8mL提取液，混匀溶解备用。 |
试剂二 | 液体4mL×1瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加15mL提取液，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体4mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | A: 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前在试剂A中加1.8mL的B液，再加23.2mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
| B: 液体2mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
注: 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
Ca2+- ATP酶活性检测：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。 4℃×12000 rpm离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超声3s, 间隔10s, 重复3 0次) ;12000rpm 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(10⁴):提取液(mL)为500~1000:1的比例 进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至700nm, 所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 100 | |
提取液 | | |
样本 | 100 | 100 |
试剂二 | 100 | |
37℃孵育20min |
试剂三 | 40 | 40 |
样本 | | 100 |
混匀，12000 rpm,4℃离心5min,上清液待测 |
③ 显色反应：
上清液 | 50 | 50 |
试剂四 | 200 | 200 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值，△A=A测定 - A对照(每个样本做 一 个自身对照)。 |
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.6402x-0.0034,x是标准品摩尔质量(μmol/mL),y是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(V1×Cpr)÷T =15.93×(△A+0.0034)÷Cpr.
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(W×V1÷V)÷T=15.93×(A+0.0034)÷W。
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每小时每1万个细菌或细胞分解 ATP产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/10⁴ cell)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.032×(△ A+0.0034)
5、液体中 Ca2+-ATPase活力计算：
定义：
每小时每毫升液体分解 ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0034)÷0.6402×V2]÷V1÷T=15.93×(△A+0.0034)V--- 加入提取液体积，1mL;V1-- 加入样本体积，0.1mL;V2--- 酶促反应总体积，0.34mL;T--- 反应时间，1/3小时；W--- 样本鲜重，g;500--- 细菌或细胞总数，万；Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议 使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmol/mL): 标准品用10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
