线粒体H+- ATP酶检测试剂盒/48样
测定意义：
线粒体是细胞呼吸代谢的重要场所，位于线粒体内膜的 H+-ATP 酶是氧化磷酸化偶联的关 键组分。H+-ATP 酶可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷，本试剂盒通过测定无机磷的 量来确定该酶活性高低。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液1 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
提取液2 | 提取液15mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体17mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加2.5mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体3mL×1支 | -20℃保存 | |
试剂四 | 粉剂×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加2.5mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂五 | 粉剂×1支 | -20℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加0.7mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂六 | 液体5mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂七 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加1.2 mL的B液，再加15.47 mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
| B:液体1.5mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注: 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器 ，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。
线粒体H+-ATP酶活性检测：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、线粒体制备(提示：整个线粒体的提取过程须保持4℃低温环境)
① 称取约0.2g 组织或收集1000 万细菌/细胞，加入1mL 提取液1,用冰浴匀浆器或研钵冰浴匀浆，转移至离心管后于4℃×3000g 离心20min。
② 小心吸取上清液(弃沉淀)移至另一离心管中，4℃×16000g 离心20min 。用移液器
移除上清液(上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的 H+-ATP酶(此步可选做))。留下沉淀(沉淀即为线粒体)。
③ 在沉淀(线粒体)中加入200 μL 提取液2,超声波破碎(冰浴，功率20%或200W,超 声 5s, 间 隔 3s, 重复30次),液体置于冰上用于线粒体 H+-ATP 酶活性测定。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取，或按照细菌/细胞数量(104):提取液(mL) 为500~1000:1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至740nm, 所有试剂解冻至室温 (25℃)。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
试剂一 | 140 | 150 |
试剂二 | 20 | 20 |
试剂三 | 30 | 30 |
试剂四 | 20 | 20 |
样本 | 40 | 40 |
混匀，静置5min |
试剂五 | 10 | |
混匀，37℃孵育20min |
试剂六 | 50 | 50 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测 |
③ 显色反应(在96孔板中操作):
上清液 | 100 | 100 |
试剂七 | 150 | 150 |
混匀，室温静置15min,740nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=1.1664x-0.0002,x 是标准品摩尔质量(μmol/mL),y是△A。
2、按液体体积计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(V1×Cpr)÷T=19.93×(△A+0.0002)÷Cpr
3、按液体体积计算：
定义：
每小时每克组织分解 ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/g鲜重)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(W×V1÷V)÷T=19.93×(△A+0.0002)÷W
4、按细胞数量计算：
定义：
每小时每1万个细菌或细胞分解ATP产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/104cell)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.04×(△A+0.0002)
5、液体中酶活力计算：
定义：
每小时每毫升液体分解 ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0002)÷1.1664×V2]÷V1÷T=19.93×(△A+0.0002)V---加入提取液体积,1mL;V1---加入样本体积,0.04mL;V2--- 酶促反应总体积,0.31mL;T---反应时间,1/3小时；W---样本鲜重，g;500---细菌或细胞总数,500 万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用 本公司的蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmol/mL): 标准品用10mL 蒸馏水溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成九个浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
