延胡索酸酶(富马酸酶)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
延胡索酸酶又名延胡索酸水化酶 (EC4.2.1.2),存在于线粒体中的富马酸酶是柠檬酸循环中的关键酶之一，存在于胞质中的富马酸酶与氨基酸和富马酸酯的代谢关系密切。在人类中，该酶缺失会导致严重的健康问题，例如胎儿脑畸形，肌张力低下等。延胡索酸酶催化延胡索酸转化成 L-苹果酸，L-苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下，同时使 NAD+ 还原成 NADH, 通过检测 NADH 在340nm 的增加速率得出延胡索酸酶的活性大 小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体60mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂二 | 液体15mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂三 | 液体0.5mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂四 | 粉体mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加3.2mL蒸馏水溶解，可分装保存。 |
试剂五 | 粉体mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加1.7mL蒸馏水溶解，-20℃保存。 |
试剂六 | 液体μL×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加1.6mL蒸馏水溶解，-20℃保存。 |
试剂七 | 液体12mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂八 | 液体mL×1支 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径1cm)、 可调式移液器、低温离心机、研钵。
延胡索酸酶活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、线粒体制备：
(提示：整个线粒体的提取过程须保持4℃低温环境):
① 称取约0 . 1g 组织或收集500万细胞，加入1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，转移至离心管后于4℃×700g 离 心 1 0min。
② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离 心 1 0min。上清液即胞浆提取物，可用于测定胞浆中的延胡索酸酶(此步可选做),沉淀为线粒体。
③ 在沉淀(线粒体)中加入200 μL试剂二和2μL试剂三，超声波破碎(冰浴，功率20%或200W, 超声3s,间隔10秒，重复30次),液体置于冰上用于线粒体中延胡索酸酶活性测定。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取，或按照细胞数量(10⁴):提取液(mL) 为500~1000:1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 1mL 石英比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 60 |
试剂四 | 60 |
试剂五 | 30 |
试剂六 | 30 |
试剂七 | 30 |
混匀，37℃孵育20min。 |
试剂八 | 30 |
混匀，立即于340nm下读取各管吸光值A1,37℃孵育30min后读取A2,△A=A2-Al。 |
注:
1、若提完的线粒体检测液样本中蛋白含量过高(如呈现浑浊状态),需减少样本加样量(如减至30μL,则试剂七相应增加),则改变后的样本体积 V1 代入计算公式重新计算。
2、若△A 差值较小，可以延长反应时间 T (如增至60min 或更长),或加大样本量 V1 ( 如增至100μL, 试剂七相应减少),则改变后的反应时间 T 和样本体积 V1 代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
在37℃下，每毫克组织蛋白每分钟产生1 nmolNADH为一个酶活单位。
延胡索酸酶活性(nmol/min/mg prot)=[△A×V2÷(ε×d)×10°]÷(V1×Cpr)÷T =62.5×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白分解 ATP 产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
酶活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0035)÷1.7406×V2]÷(V1×Cpr)÷T=13.36×(△A+0.0035)÷Cpr。
3、按细菌/细胞密度计算：
延胡索酸酶活性(nmol/min/10⁴cell)=[△A×V2÷(ε×d)×10°]÷(500×V1÷V)÷T=0.025×△V---加入提取液体积,1mL; V1---加入样本体积， 0.06mL;V2---酶促反应总体积，0.465mL; T---反应时间，1/3小时；W---样本鲜重, g;500---细菌或细胞总数，500万。Cpr---样本蛋白质浓 度，mg/mL;建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。V1---加入样本体积，0.06 mL;V---加入提取液体积，0.202 mL;V2---反应体系总体 积，7×10⁻4 L;d---光径,1cm;T---反应时间，30 min;W--- 样本质量，g;E---NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm;500---细胞数量，万； Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL,建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
