延胡索酸酶(富马酸酶)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
延胡索酸酶又名延胡索酸水化酶（EC4.2.1.2），存在于线粒体中的富马酸酶是柠檬酸循环中的关键酶之一，存在于胞质中的富马酸酶与氨基酸和富马酸酯的代谢关系密切。在人类中，该酶缺失会导致严重的健康问题，例如胎儿脑畸形，肌张力低下等。延胡索酸酶催化延胡索酸转化成 L-苹果酸，L-苹果酸在苹果酸脱氢酶的作用下，同时使 NAD+还原成NADH，通过检测 NADH 在 340nm 的增加速率得出延胡索酸酶的活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体120mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂二 | 液体30mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂三 | 液体0.5mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂四 | 粉体mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加2.1mL蒸馏水溶解，可分装保存。 |
试剂五 | 粉体mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解，-20℃保存。 |
试剂六 | 液体μL×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解，-20℃保存。 |
试剂七 | 液体13mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂八 | 液体mL×1支 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。
延胡索酸酶活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）：
① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一 ，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，转移至离心管后于 4℃×700g 离心 10min。
② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离心10min。上清液即胞浆提取物，可用于测定胞浆中的延胡索酸酶（此步可选做），沉淀为线粒体。
③ 在沉淀（线粒体）中加入 200μL 试剂二和 2μL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W ，超声 3s ，间隔 10 秒，重复 30 次） ，液体置于冰上用于线粒体中延胡索酸酶活性测定。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例进行提取，或按照细胞数量(10⁴)：提取液(mL)为 500~1000： 1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂四 | 20 |
试剂五 | 10 |
试剂六 | 10 |
试剂七 | 130 |
混匀，37℃孵育20min。 |
试剂八 | 10 |
混匀，立即于340nm下读取各管吸光值A1,37℃孵育30min后读取A2,△A=A2-Al。 |
注：
1、若提完的线粒体检测液样本中蛋白含量过高（如呈现浑浊状态) ，需减少样本加样量（如减至10μL，则试剂七相应增加)，则改变后的样本体积 V1 代入计算公式重新计算。
2、若△A 差值较小，可以延长反应时间 T（如增至 60min 或更长） ，或加大样本量 V1（如增至 40 μL，则试剂七相应减少），则改变后的反应时间 T 和样本体积 V1 代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按照组织质量计算：
酶活定义：
在 37℃下，每毫克组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADH 为一个酶活单位。
延胡索酸酶活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA ×V2÷(ε×d) ×109]÷ (V1 ×Cpr)÷T=107.2 ×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：
在 37℃下，每克组织每分钟产生 1 nmol NADH 为一个酶活单位。
延胡索酸酶活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA ×V2÷(ε×d) × 10⁹)÷ (W ×V1÷V)÷T=21.7 ×ΔA÷W
3、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：
在 37℃下，每1万个细菌/细胞每分钟产生1 nmol NADH为一个酶活单位。
延胡索酸酶活性(nmol/min/10⁴cell)=[ΔA ×V2÷(ε×d) ×10⁹)÷(500 ×V1÷V) ÷T=0.044×ΔAV1---加入样本体积，0.02 mL；V---加入提取液 体积，0.202 mL；V2---反应体系总体积，2×10-4 L；d---96 孔板光径，0.5cm；T---反应时间，30 min；W---样本质量，g；ε---NADH摩尔 消光系数，6.22 × 10³ L/mol/cm；500---细胞数量，万；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
