ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ATP-PEPCK)试剂盒/48样
测定意义：
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK)属于裂解酶家族，分为两种类型：一类是ATP 依赖性即ATP-PEPCK(EC 4.1.1.49),主要存在于开花植物、藻类及部分真菌和细菌中。另一 类是GTP 依赖性即GTP-PEPCK(EC 4.1.1.32),主要存在于哺乳动物、鸟类、鱼类、昆 虫、软体动物、扁虫、线虫、眼虫及部分真菌和细菌中。PEPCK-ATP 催化磷酸烯醇式丙 酮酸生成草酰乙酸，进一步在苹果酸脱氢酶的催化下，使 NADH 氧化生成 NAD+, 在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加6.2mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂二 | 粉剂mg×4支 | 4℃保存 | 每支加0.6mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂三 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加2.1mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂四 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径1cm)、 台式离心机、可调式移液器、研 钵、冰和蒸馏水。
ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ATP-PEPCK)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、线粒体制备：
① 组织样本：称取约0. 1g组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/真菌样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W,超声3s,间隔10s, 重复3 0次);4℃×12000rpm离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积 (mL)为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在1mL 石英比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 120 |
试剂二 | 40 |
试剂三 | 40 |
试剂四 | 560 |
样本 | 40 |
混匀，30℃条件下，立即于340nm处读取吸光值A1,5min后读取A2值，△A=A1-A2。 |
注:
1、若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到10min 或更长读取 A2, 改变后的反应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。
2、若起始值 A 太大如超过2(如颜色较深的植物叶片， 一般色素较高，则起始值相对会偏高),可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置5min 后12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 上清液用于检测。
3、若△A 大于0.6,可减少反应时间时间(如2min), 则改变后的反应时间 T 代入计算公式重新计算。
4、若下降趋势不稳定，可以每隔10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义
每毫克组织蛋白每分钟消耗1nmolNADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/mgprot)=[△A÷(ε×d)×V2×10°]÷(V1×Cpr)÷T=643.1×A÷Cpr。
2、按样本鲜重计算：
酶活定义
每克组织每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/g鲜重)=[△A÷(ε×d)×10⁹×V2]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×△A÷W。
3、按细菌或细胞密度计算：
酶活定义
每1 万个细胞每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/10⁴cell)=[△A÷(ε×d)×10⁹×V2]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×△A。
4、按照液体计算：
酶活定义
每毫升液体每分钟消耗1nmolNADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/mL)=[△A÷(Exd)×10⁹×V2]÷V1÷T=643.1×△A。E---NADH摩尔消光系数， 6.22×10³L/mol/cm;d--- 光径,1cm;V--- 加入提取液体积,1 mL;V1---加入样本体积,0.04mL;V2---反应体系总体积，8×10-4L;T--- 反应时间，5min;W--- 样本质量，g;500--- 细菌或细 胞总数，500万。Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。
