ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(ATP-PEPCK)试剂盒/96样
测定意义：
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK)属于裂解酶家族，分为两种类型：一类是ATP依赖性即ATP－PEPCK（ EC 4.1.1.49），主要存在于开花植物、藻类及部分真菌和细菌中。另一类是 GTP 依赖性即 GTP－PEPCK（ EC 4.1.1.32），主要存在于哺乳动物、鸟类、鱼类、昆虫、软体动物、扁虫、线虫、眼虫及部分真菌和细菌中。
ATP－PEPCK 催化磷酸烯醇式丙酮酸生成草酰乙酸，进一步在苹果酸脱氢酶的催化下，使NADH 氧化生成 NAD+ ，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PEPCK 活性。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体110mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再加 3.2mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂二 | 粉剂mg×4 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，每支加 0.3mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂三 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使试剂落入底部，再1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂四 | 液体14mL×1 瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔 板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
ATP-磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（ATP-PEPCK)活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；4℃×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
注：也可按照细菌或细胞数量(10⁴个)：提取液体积(mL)为 500~1000： 1 的比例进行提取。
③ 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
试剂一 | 20 |
试剂二 | 20 |
试剂三 | 10 |
试剂四 | 10 |
样本 | 130 |
混匀，30℃条件下，立即于340nm处读取吸光值A1,5min后读取A2值，△A=A1-A2。 |
注：
1、若△A 的值在零附近，可以适当延长反应时间到10min 或更长读取 A2，改变后的反应时间需代入计算公式重新计算。或适当加大样本量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。
2、若起始值 A 太大如超过 2（如颜色较深的植物叶片，一般色素较高，则起始值相对会偏高）,可以适当减少样本加样量，则改变后的加样体积需代入计算公式重新计算。或向待测样本中加少许活性炭混匀静置 5min 后 12000rpm, 4℃离心 10min，上清液用于检测；
3、若△A 大于 0.6，可减少反应时间时间（如 2min） ，则改变后的反应时间 T 代入计算公式重新计算。
4、若下降趋势不稳定，可以每隔 10S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK（nmol/min/mg prot）＝[ΔA÷(ε×d）×V2 × 10⁹] ÷ (V1 ×Cpr) ÷T=1286.2×Δ A÷Cpr。
2、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA÷(ε×d）× 10⁹ ×V2] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=1286.2×Δ A÷W。
3、按细菌/细胞密度计算：
酶活定义：
每1万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK（nmol/min/104 cell）＝[ΔA÷(ε×d）× 109⁹ ×V2] ÷ (500 ×V1÷V) ÷T=2.57×Δ A。
4、按照液体计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟消耗1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK（nmol/min/mL）＝[ΔA÷(ε×d）×10⁹ ×V2] ÷V1÷T=1286.2×ΔA ε---NADH 摩尔消光系 数，6.22 × 10³ L/mol/cm； d---96 孔板光径，0.5cm；V---加入提取液体积,1 mL; V1---加入样本体积,0.01 mL；V2---反应体系总体积,2 × 10-4 L;T---反应时间,5min;W---样本 质量,g;500---细菌或细胞总数,500 万。Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
