磷酸转乙酰酶(PTA)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
磷酸转乙酰酶 (PTA,EC 2.3.1.8)是与乙酸代谢相关的关键酶之一。磷酸转乙酰酶 (PTA)催化辅酶 A 和乙酰磷酸反应生成乙酰辅酶 A 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的 增加量来测定 PTA 酶活性大小。反应式：CoA+acetyl phosphate气acetyl-CoA+phosphate。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 提取液30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加0.55mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂四 | 液体4mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前加2.9mL的B液，再加37.1mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
| 粉体mg×1支 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注: 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL玻璃比色皿(光径1cm)、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
磷酸转乙酰酶(PTA)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、线粒体制备：
① 组织样本：称取约0 . 1g 组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心15min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 细胞样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细胞(冰浴，功率20%或200W, 超 声 3s, 间 隔 1 0s,重 复 3 0 次);4℃约12,000rpm 离 心 1 0min, 取上清作为待测样品。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(104):提取液 (mL)为500~1000:1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上,设置温度37℃,调节波长至700nm, 蒸馏水调零。②试剂放在37℃水浴5min, 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 260 | 280 |
试剂一 | 20 | 20 |
试剂二 | 150 | 150 |
试剂三 | 20 | |
30℃条件下孵育30min。 |
试剂四 | 60 | 60 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测。 |
③ 显色反应，在1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中依次加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂五 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照 (每个样本做一个自身对照)。 |
注: 若△A 差值小于0.01,可增加样本取样质量 W (如增至0.2g), 或增加②步中样本 加样体积 V1(如由150μL 增至300μL, 则试剂一相应减少),或延长②步中30℃条件下孵 育时间 T (如由30min 延至60min), 则改变后的 W 和 V1 和 T 需代入计算公式重新 计。
结果计算
1、标准曲线方程：
y=0.0317x-0.0095,x 是标准品摩尔质量：nmol,y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白催化底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(V1×Cpr)÷T=8.03×(△A +0.0164)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织催化底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA 活力(μ mol/h/g鲜重)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(W×V1÷V)÷T=8.03×(△A+0.0164)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每小时每1 万个细菌或细胞催化底物产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA活力(μmol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0164)÷0.8474×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.016×(△A+0.0164)V---加入提取液体积，1mL;V1---加入样本体 积，0.15mL;V2---酶促反应总体积，0.51mL;T---反应时间，1/2小时； W--- 样本鲜重，g;500---细菌或细胞总数，500万；Cpr---样本蛋白质 浓度，mg/mL; 建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(50μmol/mL): 标准品用1mL 试剂一溶解。(母液需在两天用)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
