磷酸转乙酰酶(PTA)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
磷酸转乙酰酶（PTA， EC 2.3.1.8）是与乙酸代谢相关的关键酶之一。磷酸转乙酰酶（PTA）催化辅酶 A 和乙酰磷酸反应生成乙酰辅酶 A 和无机磷，通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 PTA 酶活性大小。反应式：CoA+acetyl phosphate⇋acetyl-CoA+phosphate
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂 mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 1.1mL 蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂三 | 粉体 mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下使试剂落入底部，再加 0.55mL蒸馏水，混匀溶解备用。 |
试剂四 | 液体 4mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | A:粉体mg×1瓶
B:液体2mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前向A中加1.8mL的B液，加 23.2mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
标准品 | 粉体 mg×1 支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
磷酸转乙酰酶(PTA)活性测定:
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm 4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例提取② 细胞样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细胞（冰浴，功率 20％200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm离心 10min，取上清作为待测样品。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，设置温度 37℃,调节波长至 700nm。
② 试剂放在37℃水浴5min，在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 180 | 190 |
试剂二 | 10 | 10 |
样本 | 100 | 100 |
试剂三 | 10 | |
30℃条件下孵育30min。 |
试剂四 | 40 | 40 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测。 |
③ 显色反应，在 96 孔板中依次加入：
上清液 | 50 | 50 |
试剂五 | 200 | 200 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照 (每个样本做一个自身对照)。 |
注：若△A 差值小于 0.01 ，可增加样本取样质量 W（如增至 0.2g），或增加②步中样本加样体积 V1(如由 100 μL 增至 200 μL，则试剂一相应减少),或延长②步中 30℃条件下孵育时间 T（如由 30min 延至 60min） ，则改变后的 W 和 V1 和 T 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y = 0.6402x - 0.0034，x 是标准品摩尔质量(μmol/mL）, y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白催化底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA活力(μ mol/h/mgprot)=[(△A+0.0034)÷ 0.6404×V2]÷ (V1×Cpr)÷T=10.62 × (△A+0.0034)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织催化底物产生 1 μ mol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA活力(μ mol/h/g鲜重)=[(△A+0.0034)÷ 0.6404 ×V2]÷ (W×V1÷V)÷T=10.62 × (△A+0.0034) ÷W
4、按细菌/细胞密度计算：
定义：
每小时每1万个细菌或细胞催化底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PTA 活力(μ mol/h/10⁴cell)=[(△A+0.0034) ÷ 0.6404 ×V2] ÷ (500 ×V1÷V) ÷T=0.021× (△ A+0.0034)V---加入提取液体积,1mL；V1---加入 样本体积，0.1mL； V2---②步中酶促反应总体积，0.34mL；T---反应时间，1/2 小时；W---样本鲜重，g；500---细菌或细胞总数，500 万； Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用1mL试剂一溶解。（母液需在两天内用）。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
