Alanopine脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
海洋无脊椎动物主要存在4种无氧代谢途径，其中葡萄糖-opine 途径在无氧代谢初期发 挥了重要作用，无脊椎动物中特有的 Opine 脱氢酶 (OpDHs)保证了这一过程的顺利进 行。Alanopine 脱氢酶(ADH;EC 1.5.1.17)是 Opine 脱氢酶 (OpDHs)系列酶中的一种。 Alanopine 脱氢酶(ADH)催化丙酮酸和特异底物丙氨酸反应生成相应的亚氨基酸，同时使 NADH 发生氧化，通过检测 NADH 在特征吸收波长340nm 处的下降速率即可得出ADH。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×2支 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分别加0.55mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存禁止反复冻融,一周内用完。 |
试剂二 | 液体μL×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体32mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
紫外分光光度计、1mL 石英比色皿(光径1cm)、 台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
Alanopine脱氢酶(ADH)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g 组织样本，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离心10min,取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W, 超声3s, 间隔10s, 重复30 次);12000rpm,4℃离心1 0min, 取上清，置冰上待测
注: 若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 紫外分光光度计预热30min 以上，调节波长至340nm, 蒸馏水调零。
② 在 1mL 石英比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 60 |
试剂一 | 20 |
试剂二 | 20 |
试剂三 | 600 |
混匀，室温(25℃)下，于340nm读取吸光值A1,5min后读取吸光值A2,△A=A1-A2。 |
注:
1、若10s后反应体系未稳定可延长到1min 后再读取A1值。
2、若△A 的值小于0.005,可以适当延长反应时 T ( 如 由 5min 增 至 1 0min) 读取 A2, 或适当加大样本量 V1 (如增至100μL, 则试剂三相应减少),则改变后的 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
3、若起始值 A1 太大如超过2(如颜色较深的样本),可以适当减少样本加样量 V1 (如减至30μL, 则试剂三相应增加),则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。
4、若△A 的值大于0.35,则需减少反应时间 T (如减至2min), 则改变后的反应时间 T需代入计算公式重新计算。
5、若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本蛋白浓度计算：
定义：
每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1nmolNADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/mgprot)=[△A×V2÷(ε×d)×10°]÷(V1×Cpr)÷T=375.13×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：
每克组织在每分钟内氧化1nmolNADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g鲜重)=[△A×V2÷(ε×d)×10°]÷(W×V1÷V)÷T=375.13×△A÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每一万个细菌或细胞每分钟内氧化1nmol NADH 所需酶量定为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/10⁴cell)=[△A×V2÷(ε×d)×10⁹÷(500×V1÷V)÷T=0.75×△A÷W
4、按照液体计算：
定义：
每毫升液体每分钟消耗1nmolNADH 定义为一个酶活力单位。
ATP-PEPCK(nmol/min/mL)=[△A÷(Exd)×10⁹×V2]÷V1÷T=643.1×△A。V---加入提取液体积，1 mL;V¹-- -加入样本体积，0.06mL;V2---反应 体系总体积，7×10-4 L;d--- 光径，1cm;S---NADH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm;W---样本质量,g;T---反应时间,5min;500---细菌或细 胞总数,万；Cpr--- 蛋白浓度 (mg/mL),建议使用本公司的BCA蛋白含量测定试剂盒。
