Alanopine脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
海洋无脊椎动物主要存在4种无氧代谢途径，其中葡萄糖-opine 途径在无氧代谢初期发 挥了重要作用，无脊椎动物中特有的 Opine 脱氢酶 (OpDHs)保证了这一过程的顺利进行。 Alanopine 脱氢酶(ADH;EC 1.5.1.17 是 Opine 脱氢酶 (OpDHs)系列酶中的一种。Alanopine 脱氢酶(ADH催化丙酮酸和特异底物丙氨酸反应生成相应的亚氨基酸，同时使 NADH 发生氧化，通过检测NADH 在特征吸收波长340nm 处的下降速率即可得出ADH 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×2支 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部,每支分别加0.55mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融,一周内用完。 |
试剂二 | 液体μL×1支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使试剂落入底部，再加1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体16mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
Alan opine脱氢酶(ADH)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g 组织样本，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm 4℃离 心 1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提取。② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌或细胞加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W, 超 声 3s,间 隔 1 0s,重复30次); 12000rpm,4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL) 为500~1000:1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm。
② 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂一 | 10 |
试剂二 | 10 |
试剂三 | 160 |
混匀，室温(25℃)下，于340nm读取吸光值A1,5min后读取吸光值A2,△A=A1-A2。 |
注：
1、若10s后反应体系未稳定可延长到1min 后再读取 A1值。
2、若△A 的值小于0.005,可以适当延长反应时 T ( 如 由 5min 增至10min) 读取 A2,或适当加大样本量 V1 (如增至40μL, 则试剂三相应减少),则改变后的 T 和 V1 需代 入计算公式重新计算。
3、若起始值 A1 太大如超过2(如颜色较深的样本),可以适当减少样本加样量 V1 ( 如 减至10μL, 则试剂三相应增加),则改变后的 V1 需代入计算公式重新计算。
4、若△A 的值大于0.35或 A2 值低于0.35,则需减少反应时间T(如减至5min) 读取 A2, 则改变后的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
5、若下降趋势不稳定，可以每隔20S 读取一次吸光值，选取一段线性下降的时间段来参与计算，相对应的 A 值也代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按样本蛋白浓度计算：
定义：
每毫克组织蛋白在每分钟内氧化1 nmolNADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。 ADH(nmol/min/mgprot)=△A×V2÷(e×d)×10⁹÷(V1×Cpr)÷T=643.1×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
定义：
每克组织在每分钟内氧化1nmolNADH 所需酶量定义为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g鲜重)=[△A×V2÷(e×d)×10⁹]÷(W×V1÷V)÷T=643.1×△A÷W.
3、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每一万个细菌或细胞每分钟内氧化1nmolNADH 所需酶量定为一个酶活力单位。
ADH(nmol/min/g鲜重)=[△A×V2÷(e×d)×10⁹]÷(500×V1÷V)÷T=1.29×△A÷W.V---加入提取液体积,1mL;V1---加入样 本体积,0.02mL;V2--- 反应体系总体积，2×10⁴ L;d---96孔板光径，0.5cm;E---NADH 摩尔消光系数6.22×10³L/mol/cm;W---样本质量，g; T--- 反应时间，5min; 500--- 细菌或细胞总数，万；Cpr--- 蛋白浓度 (mg/mL), 建议使用本公司的 BCA 蛋白含量测定试剂盒。
