磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
磷脂酸磷酸酯酶也称为磷酸化酶磷酸酯酶 (EC 3.1.3.17,PPase) 是磷酸酯酶中的一种，在脂类合成的信号传递中发挥着重要作用，其活性对含油量的提高具有重要意义，可作为育种选择高含油量品种的生化指标。本试剂盒利用磷脂酸磷酸酯酶 (PPase) 催化β-甘油磷酸分解产生无机磷分子，通过定磷试剂测定无机磷增加速率，即可得出磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体30mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉末全部落入底部，加入9mL蒸馏水混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前在试剂A中加5.8mL的B液，再加74.2mL的蒸馏水，混匀溶解备用。 |
| B:液体6mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
注: 全程需无磷环境；试剂配置好用新枪头和玻璃移液器等，也可用一次性塑料器皿，避免磷污染。
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 液体样本：直接检测；若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30 min 以上，调节波长到700nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温(25℃)。
③ 依次在 EP 管孔板中加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 300 | 300 |
试剂一 | 75 | |
试剂二 | 75 | |
35℃孵育30min。 |
试剂三 | 150 | 150 |
样本 | | 75 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,上清液待测。 |
③ 显色反应，在1mL 玻璃比色皿(光径1cm) 中依次加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂四 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值，△A=A测定-A对照 (每个样本做一个自身对照)。 |
注:
若△A 在零附近，可增加样本加样体积 V1 (如增至100μL, 则试剂一相应减少),或延长反应时间 T (如增至1小时),则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线方程：
y=0.0317x-0.0095,x 是标准品摩尔质量：nmol,y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μmol/h/mgprot)=[(△A+0.0098)÷0.8009×V2]÷(V1×Cpr)÷T =20×(△A+0.0098)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μ mol/h/g 鲜重)=[(△A+0.0098)÷0.8009×V2]÷(W×V1÷V)÷T=20×(△A+0.0098)÷W
4、液体中 PPase 活力计算：
定义：
每小时每毫升液体催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μmol/h/mL)=[(△A+0.0098)÷0.8009×V2]÷V1÷T=20×(△A+0.0098)V---提取液体积, 1mL;V1--- 样本体积，0.075mL;V2--- 酶 促反应总体积，0.6mL;T---反应时间，1/2小时；W--- 样本鲜重,g;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL; 建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(50μmol/mL): 标准品用1mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
