磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
磷脂酸磷酸酯酶也称为磷酸化酶磷酸酯酶（ EC 3.1.3.17 ，PPase）是磷酸酯酶中的一种，在脂类合成的信号传递中发挥着重要作用，其活性对含油量的提高具有重要意义，可作为育种选择高含油量品种的生化指标。本试剂盒利用磷脂酸磷酸酯酶（ PPase）催化β-甘油磷酸分解产生无机磷分子，通过定磷试剂测定无机磷增加速率 ，即可得出磷脂酸磷酸酯酶（ PPase）活性大小。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体40mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉末全部落入底部， 加入11mL蒸馏水混匀溶解备用。 |
试剂三 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前在试剂A中加3.6mL的B液，再加46.4mL的蒸馏水,混匀溶解备用。 |
| B:液体4mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、低温离心机、水浴锅或恒温培养箱、可调式移液器、研钵、冰。
磷脂酸磷酸酯酶(PPase)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程 ，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g 组织,加入1mL提取液,进行冰浴匀浆。4℃ × 12000rpm离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例进行提取。
② 液体样本：直接检测；若浑浊 ，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30 min以上，调节波长到700nm，所有试剂解冻至室温(25℃)。
② 依次在EP管孔板中加入：
试剂名称(µL） | 测定管 | 对照管 |
试剂一 | 200 | 200 |
试剂一 | 50 | 50 |
样 本 | 50 | 650 |
35 ℃孵育30min |
混匀，室温静置 5min |
试 剂 三 | 100 | 100 |
样 本 | | 50 |
混匀,12000rpm, 4℃离心5min,上清液待测 。 |
③ 显色反应 ，在 96 板中加入：
上 清 液 | 50 | 50 |
试 剂 四 | 200 | 200 |
混匀,室温静置3 m i n,70 0 n m下读取各管吸光值,△ A= A测 定 -A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
注：若△A 在零附近,可增加样本加样体积V1（如增至100μL,则试剂一相应减少），或延长反应时间 T(如增至1小时)，则改变后的 V1 和T需代入公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线方程：
y =0.6161x - 0.0038，x 是标准品浓度(μmol/mL), y 是△A。
2、按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μmol/h/mg prot) =[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷ (V1 ×Cpr) ÷T=26× (△A+0.0038)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μmol/h/g 鲜重) =[(△A+0.0038)÷0.6161 ×V2]÷ (W ×V1 ÷V) ÷T =26× (△A+0.0038)÷W
4、液体中PPase 活力计算:
定义：
每小时每毫升液体催化产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
PPase 酶活力(μmol/h/mL) =[(△A+0.0038)÷0.6161×V2]÷V1 ÷T =26× (△A+0.0038) V---提取液体积，1mL；V1---样本体积，0.05mL；V2 ---酶促反应总体积，0.4mL；T---反应时间，1/2 小时；W---样本鲜重，g；Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测 试剂盒。
附 ：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（50μmol/mL）：标准品用1mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液用蒸馏水稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1. μmol/mL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作,根据结果即可制作标准曲线。
