胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶（ctGPD，EC 1.1.1.8）的酶活水平直接决定了葡萄糖分解代谢过程中向甘油合成方向的物质流分配量，也因此决定甘油的生成水平。ctGPD 为 NAD 依赖型，催化磷酸二羟丙酮生成 3-磷酸甘油。通过 340nm 下测定 NADH的下降量，进而得出 ctGPD 的酶活性大小。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×3 支 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，每支分别加0.44mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂-20℃保存，禁止反复冻融，三天内用完。 |
试剂二 | 液体17mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 粉剂mg×1 支 | 4℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，加 1.1mL 蒸馏水充分溶解。 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、可调试移液器、台式离心机 、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。
胞浆-3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.1g 组织（水分充足的样本可取 0.5g）到研钵内，加入1mL 提取液，在冰上进行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm ，4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
注：也可以按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例提取。
② 细菌/真菌样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌/真菌加入1mL提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌（冰浴，功率20％或 200W，超声3s，间隔 10s，重复30次）；12000rpm， 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
注：也可按照细菌或细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为 500~1000 ：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。
② 在96孔板中依次加入下列试剂：
试剂名称(µL） | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂一 | 10 |
试剂二 | 160 |
试剂三 | 10 |
混匀后立即在340nm处读取A1值，5min 后读取A2。ΔA=A1-A2。 |
注：若加完试剂三即启动反应，所以试剂三加完需立即检测，若A1超过1.2 或ΔA超过0.35，则减少样本上样量，试剂二相应增加保持原体系不变（如样本上样量减为10 μL 时，试剂二增为170μL），或减少反应时间T（如减为 2min）。则改变后的V1 和反应时间 T 需带入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每克组织每分钟内氧化1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
CtGPD(nmol/min/g鲜重)＝[ΔA ×V2 ÷(ε×d）×10⁹]÷ (W × V1÷V) ÷T=643.1×ΔA÷W
2、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟内氧化1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
ctGPD(nmol/min/mg prot)＝[ΔA ×V2 ÷(ε×d）×10⁹]÷ (V1 ×Cpr) ÷T =643.1 ×ΔA÷Cpr
3、按细胞数量计算：
酶活定义：
每10⁴个细胞每分钟内氧化1 nmol NADH 定义为一个酶活单位。
ctGPD（nmol/min/10⁴cell)=[ΔA×V2 ÷(ε×d）×10⁹]÷ (500 ×V1÷V) ÷T=1.29×ΔA
4、按液体体积计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟内氧化1nmol NADH 定义为一个酶活单位。
ctGPD（nmol/min/mL） =[ΔA ×V2 ÷(ε×d）×10⁹]÷V1÷T=643.1×ΔA V---加入提取液体积,1mL；V1---加入样本体积，0.02mL；V2---反 应体系总体积，2 × 10-4 L； d---光径，0.5cm；ε---NADH 摩尔消光系数,6.22 × 10³ L / mol /cm；W---样本质量,g;T---反应间,5min;Cpr--- 蛋白浓度(mg/mL),建议使用本公司的BCA蛋白含量测定试剂盒。
