线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mt-GPD)活性检测试剂盒/96样
测定意义：
线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mt-GPD）存在于线粒体中，在 3-磷酸甘油途径中起重要作用 ，催化底物 3-磷酸甘油生成磷酸二羟丙酮，同时生成的电子和氢进入呼吸链参与氧化磷酸化；在电子传递体（PMS）存在下，使噻唑蓝（MTT）还原生成蓝色产物，通过检测该蓝色产物在 550nm 处的增加速率，即可得出 mt-GPD 活性大小。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
试剂一 | 液体100mL×1瓶 | -20℃保存 | |
试剂二 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | 液体0.2mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉剂 mg×2支 | | 用前甩几下使试剂落入底部，每支加 0.6mL一周内用完。 |
试剂五 | 粉剂 mg×4支 | | 用前甩几下使试剂落入底部，每支加 0.3mL的蒸馏水溶解。一天内用完。 |
试剂六 | 液体17mL×1瓶 | | |
试剂七 | 粉剂mg×1 支 | | 用前甩几下使试剂落入底部，临用前加 1.1mL 蒸馏水溶解。 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、可调试移液器、台式离心机 、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。
线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶(mtGPD)活性测定 :
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、线粒体制备（提示：整个线粒体的提取过程须保持 4℃低温环境）：
① 称取约0.1g组织或收集500万细菌/细胞，加入1mL 试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆，转移至离心管后于 4℃×700g离心10min。
② 弃沉淀，上清液移至另一离心管中，4℃×12000g 离心 10min。用移液器移除上清液(上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的酶活性（此步可选做）)，留下沉淀淀即为线粒体）。
③ 在沉淀（线粒体）中加入200μL 试剂二和 2μL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3s，间隔 10 秒，重复 30 次），液体置于冰上用于线粒体-3-磷酸甘油脱氢酶（mtGPD）活性测定。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1 ：5~10 的比例进行提取，或按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL)为500~1000：1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 550nm。
② 在96孔板中依次加入下列试剂：
试剂名称(µL） | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂四 | 10 |
试剂五 | 10 |
试剂六 | 150 |
试剂七 | 10 |
混匀后立即在340nm处读取A1值，5min 后读取A2。ΔA=A1-A2。 |
注：加完试剂四即启动反应，所以试剂四加完需立即检测，若ΔA 小于 0.05，则增加样本上样量 V1，试剂三相应减少保持原体系不变（如样本上样量为 40μL 时，试剂三为 130 μL）。则改变后的 V1 需带入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本鲜重计算：
酶活定义：
每毫克组织蛋白每分钟还原1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。
MtGPD活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA ×V2 ÷(ε×d）× 10⁹]÷ (V1×Cpr) ÷T=493.8×ΔA÷Cpr
2、按样本蛋白浓度计算：
酶活定义：
每克组织每分钟还原1 nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活性单位。
mtGPD 活性（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA ×V2 ÷(ε×d）× 10⁹] ÷ (W ×V1÷V) ÷T=99.8×ΔA÷W
3、按细胞数量计算：
酶活定义：
每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1nmol 噻唑蓝（MTT）定义为一个酶活单位。
mtGPD活性(nmol/min /10⁴cell)＝[ΔA×V2÷(ε×d)× 10⁹] ÷ (500 ×V1÷V) ÷T=0.2×Δ Aε---还原型MTT 的摩尔消光系数,8.1×10³ L/mol/cm;d---96孔板光径,0.5cm;V---加入提取液体积,0.202mL; V1---加入样本体积,0.02 mL;V2---反应体系总体积,2 × 10-4 L;T---反应时 间,5min；
