3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性检测试剂盒/24样
测定意义：
3-磷酸甘油酯酶 (GPP,EC3.1.3.21) 催化3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油，是甘油合成过程中的后一步酶促反应，该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。本试剂盒采用3-磷酸甘油为底物，用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸根离子的量，进而得出3-磷酸甘油酯酶的活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体35mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，临用前加3.6mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂4℃保存。 |
试剂二 | 液体3mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前在试剂A中加2.7mL的B液，再加34.8mL的蒸馏水，混匀溶解备用。用不完的试剂4℃保存，若试剂变色则舍弃。 |
| B:液体3mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
注: 全程操作需无磷环境；试剂配置好用新的枪头和玻璃移液器等，也可以用一次性塑料器皿，免磷污染。
所需的仪器和用品：
分光光度计,1mL玻璃比色皿(光径1cm),可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰。
α - 磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 . 1g组织(水分充足的样本可取0.5g) 到研钵内，加入1mL提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃离心1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可以按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例提取。
② 细菌/真菌样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌/真菌加入1mL 提取液冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴，功率20%或200W, 超声3s, 间隔1 0s, 重复30次);12000rpm,4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积 (mL) 为500~1000:1 的比例进行提取)。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至700nm, 蒸馏水调零。
② 在EP管中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 60 | 60 |
提取液 | 60 | 60 |
试剂一 | 60 | 60 |
试剂二 | 60 | 60 |
试剂三 | | 60 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,取上清待测。 |
③ 显色反应，在 EP 管中加入：
上清液 | 150 | 150 |
试剂三 | 600 | 600 |
混匀，室温静置3min,全部液体转移至1mL玻璃比色皿(光径1cm),700nm下读取各管吸光值。A,△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照) 。 |
结果计算
1、标准曲线方程：
y=0.6624x-0.003,x 是标准品摩尔质量(μmol/mL),y是△A
2、 按蛋白浓度计算：
定义：
每小时每1万个细菌或细胞分解底物产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/104cl)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△ A+0.003)。
每小时每毫克组织蛋白分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mgprot)=【(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(V1×Cpr)÷T=12.08×(△ A+0.003)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/g 鲜重)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(W×V1÷V)÷T=12.08×(△A+0.003)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每小时每1 万个细菌或细胞分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/104 cell)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.024×(△A+0.003)
5、按液体体积计算：
定义：
每小时每毫升液体分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mL)=[(△A+0.003)÷0.6624×V2]÷V1÷T=12.08×(△A+0.003)V---加入提取液体积，1mL;V¹---加入样本体积，0.06mL;V2---酶促 反应总体积，0.24mL;T---反应时间，1/2小时；W---样本鲜重，g;500---细菌或细胞总数，500万。Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本 公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmol/mL): 标准品用10mL 试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成六个浓度：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL 。 也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线
