3-磷酸甘油酯酶(GPP)活性检测试剂盒/48样
测定意义：
3-磷酸甘油酯酶(GPP,EC3.1.3.21) 催化3-磷酸甘油脱下磷酸根离子形成甘油，是甘油合成过程中的后一步酶促反应，该酶活性的高低直接决定甘油的生成水平。本试剂盒采用3-磷酸甘为底物，用钼酸铵显色剂测定单位时间内酶催化产生的磷酸根离子的量，进而得出3-磷酸甘油酯酶的活性大小。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1瓶 | -20℃保存 | 用前甩几下或离心使粉剂落入底部，临用前加6mL蒸馏水溶解备用。用不完的试剂4℃保存。 |
试剂二 | 液体6mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂三 | A:粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前在试剂A中加1.8mL的B液，再加23.2mL的蒸馏水，混匀溶解备用。用不完的试剂4℃保存，若试剂变色则舍弃。 |
| B:液体2mL×1瓶 | | |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、EP 管、96孔板、可调试移液器、台式离心机、水浴锅、研钵、冰和蒸馏水。
a-磷酸甘油酯酶(GPP)活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：取约0 . 1g 组织(水分充足的样本可取0.5g) 到研钵内，加入1mL提取液，在冰上进 行冰浴匀浆或者液氮研磨。12000rpm,4℃离心1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可以按照组织质量 (g):提取液体积(mL)为1:5~10的比例提取。
② 细菌/真菌样本：先收集细菌/真菌到离心管内，离心后弃上清；取500万细菌/真菌加入1mL 提取液；冰浴超声波破碎细菌/真菌(冰浴，功率20%或200W, 超 声 3s,间 隔 1 0s,重 复 3 0 次 ) ; 12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 取上清，置冰上待测。
注: 也可按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例进行提取。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清液检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 770nm。
② 在EP中依次加入下列试剂：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | |
提取液 | 50 | 50 |
试剂一 | 50 | 50 |
混匀，37℃孵育30min。 |
试剂二 | 50 | 50 |
样本 | | 50 |
混匀，12000rpm,4℃离心5min,取上清待测。 |
③ 显色反应，在96孔板中加入：
上清液 | 50 | 50 |
试剂三 | 200 | 200 |
混匀，室温静置3min,700nm下读取各管吸光值A,△A=A测定-A对照(每个样本做一个自身对照)。 |
结果计算
1、按样本质量计算：
y=0.5117x+0.0026,x是标准品摩尔质量(μmol/mL),y是△A。
2、按样本质量计算：
定义：
每小时每毫克组织蛋白分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mgprot)=[(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(V1×Cpr)÷T=15.63×(△ A-0.0026)÷Cpr.
3、按样本鲜重计算：
定义：
每小时每克组织分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/g鲜重)=[(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(W×V1÷V)÷T=15.63×(△ A-0.0026)÷W。
4、按细菌或细胞密度计算：
定义：
每小时每1 万个细菌或细胞分解底物产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/104cell)=(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷(500×V1÷V)÷T=0.031×(△ A-0.0026)。
5、按液体体积计算：
定义：
每小时每毫升液体分解底物产生1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。
GPP(μmol/h/mL)=[(△A-0.0026)÷0.5117×V2]÷V1÷T=15.63×(△A-0.0026)。V---加入提取液体积，1mL;V1---加入样本体积，0.05mL;V2--- 酶促反应总体积，0.2mL; T--- 反应时间，1/2 小时；W--- 样本鲜重，g; 500---细菌或细胞总数，500万。Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(5μmol/mL): 标准品用10mL试剂一溶解。(母液需在两天内用)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1. μmol/mL.可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据显色反应阶段测定管的加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
