GABA转氨酶(GABA-T)检测试剂盒/24样
测定意义：
Y-氨基丁酸转氨酶(GABA-T,EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的关键酶之一，催化 GABA的降解和转化。本试剂盒利用γ-氨基丁酸转氨酶 (GABA-T) 催化丙酮酸和 GABA 反应生 成生成琥珀酸半醛和丙氨酸，通过检测 GABA 的减少量进而得出 GABA-T 酶活力大小。 反应方程式：4-aminobutanoate +pyruvate =succinate semialdehyde+L-alanine。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加3mL试剂三溶解备用。 |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加5mL试剂三溶解备用。 |
试剂三 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体11mL×瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体10mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂六 | A:液体13mL×2瓶
B:液体2mL×1瓶 | 4℃保存 | 临用前取0.9mL的B液进一瓶A液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六半个月内用完。 |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm),水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
Y -氨基丁酸转氨酶(GABA -T)活性测定 ：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
取约0 . 1g 组织，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm,4℃ 离 心 1 0min, 取上清液待用。
注: 若增加样本量，可按照组织质量(g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例进行提
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至645nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温，在EP管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 80 | 80 |
试剂一 | 80 | |
蒸馏水 | | 80 |
试剂二 | 80 | 80 |
混匀，于30℃孵育30min。 |
试剂三 | 160 | 160 |
立即混匀，室温12000rpm,离心5min,上清液待测。 |
③ 显色反应，在 EP 管中加入：
上清液 | 100 | 100 |
试剂四 | 60 | 60 |
试剂五 | 200 | 200 |
试剂六 | 400 | 400 |
混匀，沸水浴(95-100℃)10min,冰浴至室温，呈现蓝绿色颜色，全部液体转移至1mL玻璃比色血中，于645nm处读取各管的A值，△A=A对照-A测定(每个样本需做一个自身对照)。 |
注: 若△A 值在零附近，可增加样本质量 W(如增至0.2g), 或延长30℃孵育时间 T(如增至1h 或更长),或加大样本量 V1(如增至1500μL, 则试剂四相应减少),则改变后的 W 和 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线：
y=0.8609x-0.0032,x 为标准品浓度(mg/mL),y 为吸光值△A。
2、 按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时消耗1mg的 GABA定义为一个酶活力单位。
GABA-T活力(mg/h/mgprot)=[(△A+0.0032)÷0.8609]×V2÷(V1×Cpr)÷T=11.62×(△A+0.0032)÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时消耗1mg的GABA 定义为一个酶活力单位。
GABA-T活力(mg/h/g鲜重)=[(△A+0.0032÷0.8609]×V2÷(W×V1÷V)÷T=11.62×(△A+0.0032)÷W
4、按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每小时消耗1mg的GABA定义为一个酶活单位。
GABA-T活力(mg/h/10⁴cell)=[(△A+0.0032)÷0.8609]×V2÷(500×V1÷V)÷T=0.03×(△A+0.0032)GPP(μmol/h/10⁴ cell) (△A+0.003)÷0.6624×V2]÷(500×V1÷V) ÷T=0.024×(△A+0.003)。
5、按液体体积计算：
单位定义：
每毫升液体每小时消耗1mg的 GABA 定义为一个酶活力单位。
GABA-T 活力(mg/h/mL)=[(△A+0.0032)÷0.8609×V2÷V1÷T=11.62×(△A+0.0032)V---提取液体积，1mL;V1--- 加入反应体系中样本体积， 0.08mL;V2---- 反应体系总体积：0.4mL;T--- 反应时间，30min=0.5h;W---样本质量，g;Cpr---- 样本蛋白质浓度，mg/mL,建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液(2mg/ml): 标准品临用前加1mL蒸馏水溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1,1.2 mg/ml。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
