GABA转氨酶(GABA-T)检测试剂盒/48样
测定意义：
γ -氨基丁酸转氨酶(GABA-T， EC 2.6.1.96)是 GABA 支路中的关键酶之一，催化 GABA的降解和转化。本试剂盒利用γ-氨基丁酸转氨酶（ GABA-T）催化丙酮酸和 GABA 反应生成生成琥珀酸半醛和丙氨酸，通过检测 GABA 的减少量进而得出 GABA-T 酶活力大小。反应方程式：4-aminobutanoate + pyruvate = succinate semialdehyde + L-alanine
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 3mL试剂三溶解备用。 |
试剂二 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 4.5mL试剂三溶解备用。 |
试剂三 | 液体 8mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体 11mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 液体 10mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂六 | A：液体 8mL×3 瓶
B：液体 2mL×1 支 | 4℃保存 | 临用前取0.55mL的B液进一瓶 A 液中，混匀后作为试剂六使用。混匀后的试剂六半个月内用完。 |
标准品 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
γ-氨基丁酸转氨酶(GABA-T)活性测定:
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：取约0.1g 组织，加入1mL提取液，冰浴匀浆, 12000rpm，4℃离心 10min，取上清液待用。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1： 5~10 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 645nm。
② 所有试剂解冻至室温，在EP管依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 40 | 40 |
试剂一 | 40 | |
蒸馏水 | | 40 |
试剂二 | 40 | 40 |
混匀,于30 ℃ 孵育30min |
试剂四 | 80 | 80 |
立即混匀,室温1 2 0 0 0 r p m, 离心5min,上清液待测 |
③ 显色反应，在96孔板中加入：
上清液 | 50 | 50 |
试剂四 | 30 | 30 |
试剂五 | 100 | 100 |
试剂六 | 200 | 200 |
混匀，沸水浴(95-100℃)10min,冰浴至室温，呈现蓝绿色颜色，若浑浊需12000rp离心5 m in,取澄清的200μL至9 6孔板中,于645nm处读取各管的A值，△ A = A对照- A测 定(每个样本需做一个自身对照)。 |
注：若ΔA值在零附近，可增加样本质量W(如增至0.2g)，或延长30℃孵育时间T如增至1h或更长)，或加大样本量 V1（如增至80μL，则试剂四相应减少)，则改变后的W和T和V1需代入计算公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线方程：
y = 0.508x - 0.0003，x为标准品质量(mg/mL)，y 为吸光值ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时消耗1mg 的GABA 定义为一个酶活力单位。
GABA-T(mg/h/mgprot)=[(Δ A+0.0003) ÷ 0.508] × V2 ÷ (V1 × Cpr) ÷ T=19.7 × ( ΔA+0.0003) ÷Cpr。
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时消耗1mg 的GABA定义为一个酶活力单位。
GABA-T (mg/h/g 鲜重)=[(ΔA+0.0003)÷0.508] ×V2÷(W ×V1÷V) ÷T=19.7 × (ΔA+0.0003)÷W。
4、按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每小时消耗1mg 的 GABA 定义为一个酶活单位。
GABA-T (mg/h/10⁴cell)=[(ΔA+0.0003)÷0.508] ×V2÷(500 ×V1÷V) ÷T=0.04 × (ΔA+0.0003)。
5、按液体体积计算：
单位定义：
每毫升液体每小时消耗1mg 的 GABA 定义为一个酶活力单位。
GABA-T(mg/h/mL)[(ΔA+0.0003)÷0.508] ×V2÷V1÷T=19.7 (A+0.0003)V---提取液体积, 1mL;V1---加入反应体系中样本体积,0.04mL;V2--- 反应体系总体积：0.2mL； T---反应时间，30min=0.5h； W---样本质量，g；Cpr---样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含 量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、标准品母液（2mg/ml）：标准品临用前加1mL蒸馏水溶解。
2、把母液稀释成以下浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2 mg/ml。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按照显色反应阶段的测定管加样体系操作，根据结果即可制作标准曲线。
