γ-谷氨酸激酶(γ-GK)检测试剂盒/24样
测定意义：
γ-谷氨酸激酶(y-GK,EC 2.7.2.11)是脯氨酸生物合成途径中的关键酶之一。催化由谷氨酸 生成脯氨酸途径的第一步反应。本试剂盒利用γ-GK 催化谷氨酸磷酸化，进一步转化为γ- 谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与 Fe3+形成 Hydroxamate-Fe3+ 复合物，通过检测该 复合物在535 nm 波长处的 OD 值，进而得出γ-GK 酶活力大小。该酶催化的反应方程 式：ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate 5-phosphate。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入10mL蒸馏水溶解备用 |
试剂三 | 液体8mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入1.8mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂五 | 液体15mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm),水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
y -谷氨酸激酶(y- G K)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织：取约0 . 1g组织，加入1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm,4℃ 离 心 1 0min,取上清液待用。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL 提取液，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率200W, 超 声 3s,间 隔 1 0s,重复30次);12000rpm 4℃离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照细菌/细胞数量(10⁴):提取液 (mL) 为500~1000:1 的比例进行提取。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至535nm, 蒸馏水调零。
② 所有试剂解冻至室温。
③ 在 EP 管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 150 | 150 |
试剂一 | 150 | 120 |
试剂二 | 150 | 150 |
试剂三 | 150 | 150 |
试剂四 | | 30 |
混匀，37℃水浴60min |
试剂五 | 300 | 300 |
混匀，反应2min后，8000rpm,4℃离心10min,取全部上清液于1mL玻璃比色皿中，535nm处分别读取吸光值A,△A=A测定管-A对照管(每个测定管须设一个对应的对照管)。 |
注: 若△A 的值在零附近徘徊，则可加大样本量 V1 (如增至200μL, 则试剂一相应减少),则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白在每小时内催化产生1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
y-GK活性(nmol/h/mgprot)=[△A×V2÷(ε×d)×10°]÷(V1×Cpr)÷T=240×△A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织在每小时内催化产生1 nmol谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
3、按细菌/真菌数量计算：
单位定义：
每10⁴个细胞在每小时内催化产生1 nmol谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活单位 (U)。
y-GK活性(nmoL/min/10⁴cell)=[△A×V2÷(ε×d)×10⁴]÷(500×V1÷V)÷T=0.48×A
4、液体中酶活力计算：
单位定义：
每毫升液体在每小时内催化产生1 nmol谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
y-GK活性(nmol/min/mL)=[△A×V2÷(Exd)×10]÷V1÷T=240×△AV---提取液体积，1mL;V1---加入反应体系中样本体积，0.15mL;V2--- 反应体 系总体积：9×10⁻4 L;d---光径,1cm;T---反应时间，60min=1h;W---样本质量，g;ε---摩尔消光系数，2.5×10⁴ L/mol/cm;Cpr----样本蛋白质浓 度，mg/mL, 建议使用本公司的 BCA蛋白含量检测试剂盒。
