γ-谷氨酸激酶(γ-GK)检测试剂盒/48样
测定意义：
γ -谷氨酸激酶(γ -GK， EC 2.7.2.11)是脯氨酸生物合成途径中的关键酶之一。催化由谷氨酸生成脯氨酸途径的第一步反应。本试剂盒利用γ-GK 催化谷氨酸磷酸化，进一步与转化为γ─谷氨酰基异羟肟酸，在酸性条件下与 Fe3+形成 Hydroxamate-Fe3+复合物 ，通过检测该复合物在 535 nm 波长处的OD 值，进而得出γ-GK酶 活 力 大 小 。 该 酶 催 化 的 反 应 方 程 式 ： ATP+L-glutamate=ADP+L-glutamate5-phosphate。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体5mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉体mg×1 瓶 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入6mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂三 | 液体5mL×1 瓶 | 4℃保存 | |
试剂四 | 粉体mg×1 支 | 4℃保存 | 临用前甩几下，使粉体落到底部，再加入1.1mL蒸馏水溶解备用。 |
试剂五 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 |
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所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、水浴锅、离心机、可调式移液器、研钵、冰和蒸馏水。
y -谷氨酸激酶(y- G K)活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液，冰浴匀浆，12000rpm ，4℃离心 10min，取上清液待用。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000rpm4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样本：澄清的液体样本直接检测，若浑浊则离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm。
② 所有试剂解冻至室温。
③ 在EP管中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 |
样本 | 50 | 50 |
试剂一 | 50 | 40 |
试剂二 | 50 | 50 |
试剂三 | 50 | 50 |
试剂四 | | 10 |
混匀，37℃水浴 60min |
试剂五 | 100 | 100 |
混匀，反应2min后，8000rpm，4℃离心0min，取200μL上清液于96孔板中，535nm处分别读取吸光值A，△A=A 测定管-A对照管（每个测定管须设一个对应的对照管）。 |
注： 若ΔA 的值在零附近徘徊，则可加大样本量 V1（如增至80 μL，则试剂一相应减少），则改变后的加样体积 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算
1、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白在每小时内催化产生1nmol谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
γ-GK活性(nmol/h/mg prot)=[ΔA ×V2÷(ε×d) × 10⁹］÷ (V1 ×Cpr) ÷T=480×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织在每小时内催化产生1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
γ-GK 活性(nmol/min/g鲜重)=[ΔA×V2÷(ε×d)× 10⁹]÷ (W×V1÷V)÷T=480×ΔA÷W
3、按细菌/细胞数量计算：
单位定义：
每10⁴个细胞在每小时内催化产生1nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活单位（U）。
γ -GK活性(nmoL/min /10⁴cell)=[ΔA ×V2÷(ε×d) × 10⁹] ÷ (500 ×V1÷V) ÷T=0.96×△A
4、液体中酶活力的计算：
单位定义：
每毫升液体在每小时内催化产生1 nmol 谷氨酰羟肟酯所需的酶量定义为一个酶活力单位。
Γ-GK 活性(nmol/min/mL)=[ΔA ×V2÷(ε×d) × 10⁹] ÷V1÷T=480×ΔA V---提取液体积,1mL；V1---加入反应体系中样本体积,0.05mL;V2---反 应体系总体积：3 × 10-4 L； d---96 孔板光径，0.5cm；T---反应时间，60min=1h； W---样本质量，g；ε---摩尔消光系数，2.5 × 10⁴ L/mol/cm；Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL，建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
