Caspase-3活性检测试剂盒/24样
测定意义：
Caspase-3 又称 CPP32、Yama 或 apopain, 属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。利用Caspase-3 分解底物 Ac-DEVD-pNA产生黄色的对硝基苯胺(pNA),后者在405nm 有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出 Caspase-3 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体0.5mL×1支 | -20℃保存 | 低温放置易冻住，放置室温使其解冻成液体再用，用不完的试剂分装后-20℃保存。 |
标准管 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、1mL 玻璃比色皿(光径1cm)、 台式离心机、可调式移液器、天平、 研钵、冰和蒸馏水。
Caspase-3活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本： 取约0 . 1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。4℃×12000rpm 离心10min, 取 上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL)为1:5~10的比例进行提取。② 细菌或培养细胞先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清取约500 万细菌或细胞加入1mL 提取液， 超声波破碎细菌或细胞(冰浴，功率20%或200W, 超声 3s, 间隔 1 0s,重复30次); 4℃×12000rpm 离心10min, 取上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照数量(104):提取液体积(mL)为500-1000:1的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，调节波长至405nm。
② 在1mL玻璃比色皿(光径1cm) 中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 80 |
试剂一 | 600 |
试剂二 | 20 |
混匀，于405nm处读取A1值，37℃反应1h后读取A2值。△A=A2-Al。 |
注:
1、加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若 A2 值大于1.5,可减少样本加样量 V1 (如减至40μL,则试剂一相应增加),或缩短反应时间 T ( 如 由 1h 减至30min), 则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。
2、若△A 小于0.01,可延长反应时间 T(如由1h增至2h或更长),则改变后的T需代入公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线：
y=0.0128x+0.0024:x为标准品(对硝基苯胺)(nmoL),y为△A。肌酐含量(nmol/g)=(C
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时催化底物产生1nmoL对硝基苯胺为一个酶活单位(U)。
Caspase-3(nmoL/h/g鲜重)=[(△A+0.0024)÷0.0128]÷(W×V1÷V)÷T=976.6×(△A+0.0024)÷W
3、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时催化底物产生1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位 (U)。
Caspase-3(nmoL/h/mgprot)=[(△A+0.0024)÷0.0128]÷(V1×Cpr)÷T=976.6×(△A+0.0024)÷Cpr
4、按细胞数量计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每小时催化底物产生1nmoL对硝基苯胺定义为一个酶活单位(U)。
Caspase-3(nmoL/h/10⁴cell)=[(△A+0.0024)÷0.0128]÷(500×V1÷V)÷T=1.95×(△ A+0.0024)V--- 加入提取液体积，1 mL;V¹--- 加入样本体 积，0.08mL;T--- 反应时间，1h;W--- 样本质量，g;500---细胞数量；D---稀释倍数，未稀释即为1;Cpr--- 样本蛋白质浓度，mg/mL,建议使用本 公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(10μmol/mL): 临用前甩几下或离心，使粉体落入底部，加入0.5mL乙醇，涡旋震荡溶解后再加入0.5mL 的蒸馏水混匀，得到10μmol/mL备用。
2、用蒸馏水把母液稀释成以下浓度：0,0.2,0.4,0.6,0.8,1μmol/mL。也可根据实际来调整浓度。
3、80μL 标准品+620 μL 试剂一，混匀后于405nm 处读取A值，依据结果即可制作标准曲线。
