Caspase-3活性检测试剂盒/48样
测定意义：
Caspase-3又称 CPP32、Yama 或 apopain，属于 CED-3 亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。
利用Caspase-3分解底物Ac-DEVD-pNA 产生黄色的对硝基苯胺(pNA)，后者在405nm 有大吸收峰，通过测定吸光值升高速率即可得出 Caspase-3 酶活性大小。
试剂盒组成和配制:
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体10mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 液体0.5mL×1支 | -20℃保存 | 低温放置易冻住，放置室温使其解冻成液体再用，用不完的试剂分装后-20℃保存。 |
标准管 | 粉体mg×1支 | 4℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品:
酶标仪、96孔板、台式离心机、可调式移液器、天平、研钵、冰和蒸馏水。
Caspase -3活性测定：
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定 ，了解本批样品情况 ，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0.1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。4℃ ×12000rpm 离心10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例进行提取。
② 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约500万细菌或细胞加入1mL提取液，超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s ，间隔10s，重复 30 次）；4℃×12000rpm 离心 10min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照数量（10⁴）：提取液体积(mL)为 500-1000 ：1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 405nm。
② 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 40 |
试剂一 | 150 |
试剂二 | 10 |
混匀,于405nm处读取A 1值，37℃反应1h后读取A 2值 。 ΔA = A 2 - A 1。 |
注：
1、测加完试剂二即启动反应，所以试剂二加完混匀后立即检测，若A2 值大于1.5，可减少样本加样量 V1（如减至10 μL，则试剂一相应增加），或缩短反应时间 T（如由1h减至 30min），则改变后的 V1 和 T 需代入公式重新计算。
2、若ΔA 小于 0.01，可延长反应时间T（如由1h增至2h或更长），则改变后的T需代入公式重新计算。
结果计算
1、标准曲线方程：
y = 0.0291x - 0.0004：x 为标准品（对硝基苯胺）(nmoL) ，y为ΔA。
1、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每小时催化底物产生1nmoL 对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。
Caspase-3(nmoL/h/g鲜重 )=[(Δ A+0.0004) ÷ 0.0291] ÷ (W ×V1÷ V) ÷ T=859.1 × (Δ A+0.0004) ÷W。
2、按样本鲜重计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每小时催化底物产生1nmoL对硝基苯胺为一个酶活单位（U）。
Caspase-3(nmoL/h/mgprot)=[( Δ A+0.0004) ÷ 0.0291] ÷ (V1 × Cpr) ÷ T=859.1 ×(ΔA+0.0004) ÷Cpr。
3、 按细菌或细胞密度计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每小时催化底物产生1nmoL对硝基苯胺定义为一个酶活单位（U）。
Caspase-3 (nmoL/h/10⁴cell)=[( Δ A+0.0004) ÷ 0.0291] ÷ (500 × V1 ÷ V) ÷ T=1.72 × ( Δ A+0.0004)V---加入提取液体积,1 mL；V1--- 加入样本体积,0.04mL；T---反应时间, 1h；W---样本质量，g；500---细胞数量；D---稀释倍数，未稀释即为1;Cpr---样本蛋白质浓度,mg/mL, 建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
