磷酸葡萄糖变位酶(PGM)检测试剂盒/48样
测定意义：
磷酸葡萄糖变位酶（PGM）在碳水化合物代谢中起关键作用，并广泛存在于所有生物体中。 PGM 可使葡萄糖-1-磷酸（G1P）和葡萄糖-6-磷酸（G6P）互变。当糖原分解时，PGM 将 G1P 转化为 G6P，接着进入糖酵解途径产生 ATP，也可通过戊糖磷酸途径产生核糖和 NADPH。相反，当细胞需要能量时PGM将G6P转化为G1P ，进而产生糖原。PGM 的缺乏可导致与葡萄糖存储相关的疾病。本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法 ：PGM 将葡萄糖-1-磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸；葡萄糖-6-磷酸通过葡萄糖-6-磷酸脱氢酶氧化形成 NADPH， 接着与特异显色剂反应生成有色物质， 通过检测该有色物在450nm 的增加速率，进而计算出 PGM 酶活性大小。
试剂组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体60mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL蒸馏水充分溶解备用。 |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 1.1mL蒸馏水充分溶解备用。 |
试剂三 | 液体2mL×1支 | 4℃保存 | |
试剂四 | 液体32mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂五 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前甩几下使粉剂落入底部，再加 2.4mL蒸馏水充分溶解备用。 |
标准品 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂。 |
所需的仪器和用品：
可见分光光度计、 1mL 玻璃比色皿（光径 1cm）、水浴锅、台式离心机、可调式移液枪。
土壤硝态氮的测定：
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约 0.1g 组织，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆。 12000rpm 4℃离心15min，取上清，置冰上待测。
注：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例提取
② 细胞样本：先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；取500 万细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细胞（冰浴，功率 20%或 200W，超声 3s ，间隔 10s，重复 30 次）；4ºC 约 12,000rpm离心10min，取上清作为待测样品。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（10⁴)： 提取液（mL）为 500~1000： 1 的比例进行提取。
2、上机检测：
① 可见分光光度计预热30min以上，设置温度 37℃,调节波长至 450nm，蒸馏水调零。
② 试剂放在37℃水浴5min；
试剂名称 (μL） | 测定管 |
样本 | 15 |
试剂一 | 60 |
试剂二 | 30 |
试剂三 | 60 |
试剂四 | 640 |
混匀,37℃条件孵育10min。 |
试剂五 | 40 |
混匀,37℃条件下，1mi n时于4 5 0nm处读取吸光值A1,11min时读取A 2，△ A = A 2 - A 1。 |
注 :
1、若ΔA过小，可以延长反应时间 T（如：21min或更长）再读取A2，或增加样本量V1（如增至80 μL，则试剂四相应减小)，重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
2、若A2 值大于1.5，可缩减反应时间 T（如：6min 或更短）再读取 A2，或减少样本量 V1（如减至20μL，则试剂四相应增加)，重新调整的反应时间 T 和 V1 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按标准曲线方程：
y = 0.0317x-0.0095，x 是标准品摩尔质量：nmol，y是ΔA。
2、按样本蛋白浓度计算：
单位定义：
每毫克组织蛋白每分钟使 1nmolNADP+转换成 1nmolNADPH 为一个酶活单位。 PGM(nmol/min/mgprot)＝( ΔA+0.0095) ÷ 0.0317] ÷ (V1 × Cpr) ÷T=78.86 × ( ΔA+0.0095) ÷Cpr
3、按样本鲜重计算：
单位定义：
每克组织每分钟使1nmolNADP+转换成1nmolNADPH 定义为一个酶活力单位。
PGM(nmol/min/g鲜重)＝[( ΔA+0.0095)÷ 0.0317] ÷ (W ×V1 ÷V) ÷T=78.86 × ( Δ A+0.0095) ÷W
4、按细胞数量计算：
单位定义：
每10⁴个细胞每分钟使 1nmolNADP+转换成1nmolNADPH定义为一个酶活单位。
PGM（nmol/min/10⁴cell)=[(ΔA+0.0095) ÷ 0.0317] ÷ (500 ×V1 ÷V) ÷T=0.158 ×(ΔA+0.0095)V---加入提取液体积, 1mL;V1---加入样本体 积，0.01 mL；W---样本质量，g； T---反应时间，10 min；Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL；建议使用本公司的BCA蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液（1nmol/μL）：向标准品EP管里面加入 0.6mL 蒸馏水（母液需在两天内用且-20℃保存）。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 nmol/ μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、依据加样表操作，根据结果即可制作标准曲线。
