丙酮酸(PA)检测试剂盒/96样
测定意义：
丙酮酸在各种生化途径中起着重要作用，可在糖异生过程中转化为碳水化合物，或通过乙酰CoA 转化为脂肪酸。乳酸脱氢酶（LDH）可使丙酮酸转化为乳酸，同时使 NADH 氧化，利用 NADH 在 340nm 的下降量来计算丙酮酸含量。
试剂组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体 100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体 30mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1支 | 4℃保存 | 临用前加1.1mL蒸馏水溶解；溶解后-20℃保存 2 周。 |
试剂三 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 临用前加1.1mL蒸馏水溶解，溶解后仍-20℃保存。 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96孔 板、台式离心机、可调式移液器、研钵、冰、蒸馏水 。
丙酮酸(PA)含量测定:
建议正式实验前选取2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 称取约 0.1g 组织，水分充足的样本可取约0.5g，加入1mL 提取液，进行冰浴匀浆， 12000rpm，室温离心10min，取上清液待测。(若组织样本蛋白含量很高，可进行脱蛋白处理）
注：若增加样本量，可按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 5~10：1 的比例进行提取
② 细菌/培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取约 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s ，间隔 10s，重复 30 次）,12000rpm，室温离心10min，取上清液待测。
注：若增加样本量，可按照细菌/细胞数量（104）：提取液（mL）为 500~1000：1 的比例进行提取。
③ 液体样品：近似中性的澄清液体样本可直接检测；若为酸性样本则需先用NaOH(2M)调 PH 值约 7.4，然后室温静置 30min，取澄清液体直接检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。
② 在 96 孔板中依次加入：
试剂名称 (μL） | 测定管 |
样本 | 10 |
试剂一 | 170 |
试剂二 | 10 |
混匀,2min后于340nm下读取A1 |
试剂三 | 10 |
混匀（轻轻拍打板子几下）,5min后于340nm下读取A2，(若吸光度继续下降，直到吸光值保持 2min内稳定不变为止。)△A=A1-A2。 |
注 : 若△A 的值在零附近徘徊，可以增加样本量 V1（相应的试剂一减少）或样本准备制备的时候，增加样本质量 W，则改变后的 V1 或 W 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、按照样品质量计算：
丙酮酸含量(µg/g鲜重)= [ΔA÷(ε×d) ×V2×Mr×10⁶] ÷ (W×V1÷V) =559.1×ΔA ÷W
2、按照细菌或细胞密度计算：
丙酮酸含量(μg/10⁴cell)＝[ΔA÷(ε×d) ×V2 × Mr × 10⁶] ÷ (500 ×V1÷V) =1.12 ×ΔA
3、按照液体体积计算：
丙酮酸含量(μg/mL)=[ΔA÷(ε×d)×V2 ×xMr× 10⁶]÷V1=559.1×ΔA ε---NADH 摩尔消光系数，6.3 ×10³L/mol/cm；d---96 孔板光径， 0.5cm；V---加入提取液体积,1mL；V1---加入反应体系中样本体积，0.01mL；V2---反应总体积，2×10-4 L；Mr---丙酮酸分子量,88.06；W--- 样本质量，g；500---细菌或细胞总数,万。
