红霉素-N-脱甲基酶(ERND)检测试剂盒 ; 100T/48S
测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND在P450酶系中相当于CYP2B亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经CYP2B代谢活化。
测定原理：
ERND催化红霉素释放甲醛，通过Nash比色测定甲醛含量，即可计算出ERND活性。
自备仪器和用品：
普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水和冰。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂× 1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水溶解。
试剂二：液体× 1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂× 1管，4℃保存。临用前加1mL蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂× 1瓶，4℃保存。临用前加0.5mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂× 1瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水4.5mL充分溶解。
试剂六：液体× 1瓶，4℃保存。
试剂七：液体× 1瓶，4℃保存。
标准液：液体× 1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mL EP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。
2、粗制微粒体：100000g，4℃, 离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。
测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、试剂二置于37℃水浴中预热30 min。
3、 对照管：取0.5mL EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm离心5min；取新的EP 管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为 A对照管。
4、 测定管：取0.5mLEP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置于37 ℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm离心5min；取新 EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min ，于412nm测定光吸收，记为 A测定管。
5、标准管：取0.5mLEP管，加入100μL标准品，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为 A 标准管。
ERND活性计算公式：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为 1 个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 45×(A测定管－
A对照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
细活性单位定义：
37℃下，每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V 样)÷T= 45×(A测定管－A对
照管)÷A标准管÷WC 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V 标准品：100μL=1×10-⁴L；稀释倍数：V反总÷V上清液=(50+850+
50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；
W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL ；T：催化反应时间(min)， 30min。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 45×(A测定管
－A对照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义：
37℃下，每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
ERND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T= 45×(A测定管－A对
照管)÷A 标准管÷WC 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：100μL=1×10-⁴ L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=(50+850
+50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂
盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积，10μL=0.01mL；T： 催化反应时间（min），30min。
注 意：每个样品都需要做对照管。
