苯胺-4羟化酶(AH)检测试剂盒 ; 50管/24样
测定意义：
细胞色素P450酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。AH在P450 酶系中相当于CYP2E1亚型，CYP2E1不仅参与了药物的代谢，而且还能催化多种前致癌物和前毒物的活化过程。
测定原理：
AH催化苯胺羟化后产生的4-氨基酚，进一步转变为酚-吲哚复合物，在630nm处有特征吸收峰；通过测定630nm吸光度增加速率，来计算 AH 活性。
自备的仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机、超速离心机、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、双蒸水和冰。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入50 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入26 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入13 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：液体×1瓶，4℃保存。
试剂六：粉剂×1瓶（腐蚀性试剂），4℃避光保存。临用前加入26 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂七：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入26 mL蒸馏水充分溶解。
标准液：液体×1瓶，10μmol/L，4℃避光保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃ ,离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：100000g 4℃, 离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。
测定操作：
1、分光光度计预热30 min，调节波长到630 nm，蒸馏水调零。
2、试剂三置于 37℃水浴中预热 30min。
3、试剂五置于冰浴预冷 30min。
4、 标准管：取1.5 mLEP管，加入500μL标准液，500μL试剂六，500μL 试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收， 记为A标准管。
5、对照管：取1支1.5 mLEP管，加入250μL粗酶液，500μL试剂三，250μL蒸馏水，混匀后37℃水浴中保温30min；再加入500μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm，4℃ , 离心10min；取500μL上清液，加入1支新的1.5 mLEP管；再加入500μL试剂六，500μL 试剂七，混匀后室温静置30min ，于630 nm测定光吸收，记为 A对照管。
6、测定管：取1支 1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL试剂三，250μL试剂四，混匀后 37℃水浴中保温30min；再加入500μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm ，4℃ , 离心10min；取 500μL上清液，加入1支新的 1.5 mL EP 管；再加入500μL试剂六，500μL试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，记为A测定管
注 意：每个样品都需要做对照管。
AH活性计算公式：
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol4-氨基酚为1个酶活单位。
AH活性(nmol/min/mg prot) = C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 2×(A测定管－A对
照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义:
37℃中每克样本每分钟催化产生1nmol4-氨基酚为1个酶活单位。
AH 活性(nmol/min/g鲜重)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T= 2×(A测定管－A对照
管)÷A标准管÷WC 标准品：10μmol/L；V标准品：500μL=0.0005L；稀释倍数：V反总÷V上清液=1500μL÷500μL=3；Cpr：粗
酶液蛋白质浓度，mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；V样：加入反应体系中粗酶液体积，250
μL=0.25 mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
