氨基比林-N-去甲基化酶(AND)检测试剂盒 ; 50管/24样
测定意义：
细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理：
AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。
自备的仪器和用品：
可见分光光度计、普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、1mL玻璃比色皿、蒸馏水、无水乙醇和冰。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入50 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂二：液体×1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1瓶（棕色瓶），4℃避光保存。临用前加入2.6 mL无水乙醇，充分溶解。
试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入2.6 mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。 临用前加蒸馏水10mL充分溶解。
试剂六：液体×1瓶，室温保存。
试剂七：：液体×1瓶，4℃保存。
标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5 mLEP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃ ,离心30min，取上清液，转移到超速离心管中。
2、粗制微粒体：100000g 4℃, 离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。
AND活性测定操作：
1、分光光度计预热30min ，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。
3、对照管：取1支EP管，加入 50μL 粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL 蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置 5min；室温8000rpm 离心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为 A 对照管。
4、测定管：取1支 EP管，加入50μL粗酶液，850μL试剂二，50μL试剂三，50μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入175μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入175μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm 离心5min；取1支新 EP 管，加入500μL上清液，500μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为 A测定管。
5、标准管：取1支 EP 管，加入500μL标准品，500μL试剂七，混匀后 60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为 A标准管。
6、测定管：取1支1.5 mL EP管，加入250μL粗酶液，500μL试剂三，250μL试剂四，混匀后 37℃水浴中保温30min；再加入500μL试剂五，混匀后冰浴5min，11000rpm ，4℃ , 离心10min；取 500μL上清液，加入1支新的 1.5 mL EP管；再加入500μL试剂六，500μL试剂七，混匀后室温静置30min，于630 nm测定光吸收，记为A测定管
注 意：每个样品都需要做对照管。
AND活性计算：
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V 样)÷T= 45×(A测定管－
A空白管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义:
37℃中每分钟每克样品催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A 标准管×稀释倍数÷(W×V样)÷T= 45×(A测定管－A对
照管)÷A标准管÷WC 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：500μL=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V上清液=(50+850
+50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度mg/mL，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒；
V样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；W：样本质量，g；T：反应时间，30min。
注意事项：
1、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加0.5ml 20%的甘油，分装后， -80℃保存；
2、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用 1 周；
3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA 法测蛋白含量。
