氨基比林-N-去甲基化酶(AND)检测试剂盒 ; 100管/48样
测定意义：
细胞色素P450酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND作为P450酶系的重要一员，相当于CYP3A4亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。
测定原理：
AND催化氨基比林释放甲醛，通过Nash比色法测定甲醛含量，即可计算出AND活性。
自备仪器和用品：
普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。
试剂组成和配制：
试剂一：粉剂× 1瓶，4℃保存。临用前加100mL蒸馏水充分溶解。
试剂二：液体× 1瓶，4℃保存。
试剂三：粉剂×1管，4℃避光保存。临用前加入1mL无水乙醇，充分溶解。
试剂四：粉剂×1管，4℃保存。临用前加入0.5mL蒸馏水，充分溶解。
试剂五：粉剂×1瓶，室温保存。 临用前加蒸馏水4mL充分溶解。
试剂六：液体×1瓶，室温保存。
试剂七：液体×1瓶， 4℃保存。
标准液：液体×1瓶，-20℃保存。临用前取1.5mLEP管，加入10μl标准液，加990μl蒸馏水，混匀即为0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。
粗酶液提取：
1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约0.5g组织，加入1 mL试剂一，冰上充分研磨，10000g 4℃离心 30min，取上清液转入超速离心管。
2、粗制微粒体：4℃ , 100000g ，离心60min，弃上清液。
3、除血红蛋白等杂质：向步骤2的沉淀中加1mL试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100000g 离心30min，弃上清液。
4、最终微粒体：向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。
AND活性测定操作：
1、分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。
2、试剂二置于37℃水浴中预热 30min。
3、对照管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL蒸馏水，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温 8000rpm离心5min；取新的EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于412nm测定光吸收，记为A对照管。
4、测定管：取1支EP管，加入10μL粗酶液，170μL试剂二，10μL试剂三，10μL试剂四，混匀后置于37℃水浴保温30min；立即加入35μL试剂五，混匀后置于冰浴中5min；取出后加入35μL试剂六，混匀后室温静置5min；室温8000rpm 离心 5min；取1支新EP管，加入100μL上清液，100μL试剂七，混匀后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于412nm测定光吸收，记为A测定管。
5、标准管：取1支EP管，加入100μL标准品，100μL试剂七，混匀后 60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷却5min，于 412nm测定光吸收，记为A标准管。
注 意：每个样品都需要做对照管。
AND活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/mg prot)=C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 45×(A测定管－A
对照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义：
37℃中每分钟每克组织催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T= 45×(A测定管
－A对照管)÷A 标准管÷WC 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：500μL=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V上清液=(50+
850 +50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试
剂盒；V样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；V样总：提取液体积，0.5mL；T：催化反应时间(min)，30min。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按蛋白浓度计算
活性单位定义：
37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/mg prot)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(Cpr×V样)÷T= 45×(A测定管－
A对照管)÷A标准管÷Cpr
(2) 按样本质量计算
活性单位定义：
37℃中每分钟每克组织催化产生1nmol甲醛为1个酶活单位。
AND活性(nmol/min/g鲜重)= C标准品×V标准品×(A测定管－A对照管)÷A标准管×稀释倍数÷(V样÷V样总×W)÷T= 45×(A测定管
－A对照管)÷A标准管÷WC 标准品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V标准品：500μL=0.0005L；稀释倍数：V反总÷V上清液=(50+
850 +50+50+175+175)÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度(mg/mL)，需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试
剂盒；V 样：加入粗酶液体积，50μL=0.05mL；V样总：提取液体积，0.5 mL；T：催化反应时间（min），30min。
