淀粉脱分支酶(DBE)检测试剂盒 ; 100管/48样

淀粉脱分支酶(DBE)检测试剂盒 ; 100管/48样

测定意义： 

DBE能够专一性地裂解支链淀粉的α-1 ，6 糖苷键，产生线性的葡萄糖链，在调整支链淀粉分子的链长方面有重要的作用。

测定原理： 

采用 3，5-二硝基水杨酸法测定 DBE 催化支链淀粉产生的还原糖，通过测定还原糖含量的变化来计算 DBE活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰、蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体15mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1支，4℃保存；临用前每支加入6mL 试剂一，充分混匀后备用；用不完的试剂 4℃保存；

试剂三：液体12mL×1瓶，4℃保存；

试剂四：液体35mL×1瓶，4℃保存。

粗酶液提取：

按照组织质量(g)：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液)，进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。

2、加样表

注 意：可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行5min-A 对照。每个测定管需设个一个对照管。

DBE活力单位的计算：

标准条件测定回归方程为y = 3.8458x - 0.165 ；x 为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值。

(1) 按照蛋白浓度计算

      单位的定义：

      每mg组织蛋白每h催化产生1mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

      DBE 活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=0.26× (ΔA+0.165) ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每g组织每分钟催化产1mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

      DBE 活力(mg /min/g鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷3.8458×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=0.26× (ΔA+0.165) ÷WV 反总：反应体系总体

      积，0.2mL； V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/

      mL；W：样本质量，g。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

标准条件测定回归方程为y = 1.9229x - 0.165 ；x 为标准品浓度(mg/mL)，y为吸光值。

(1) 按照蛋白浓度计算

      单位的定义：

      每 mg 组织蛋白每h催化产生1mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

      DBE活力(mg /min /mg prot)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V 反总]÷(V 样×Cpr)÷T=0.52× (ΔA+0.165) ÷Cpr

(2) 按样本鲜重计算

      单位的定义：

      每g组织每分钟催化产生1mg葡萄糖定义为一个酶活力单位。

      DBE 活力(mg /min /g 鲜重)=[ (ΔA+0.165)÷1.9229×V 反总]÷(W×V样÷V样总) ÷T=0.52× (ΔA+0.165) ÷WV 反总：反应体系总

      体积，0.2mL； V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 h；Cpr：样本蛋白质浓度，

      mg/mL；W：样本质量，g。标准曲线线性范围为 0.1mg/mL-1mg/mL。ΔA 线性范围为 0.01-1。