结合态淀粉合成酶(GBSS)检测试剂盒 ; 100管/96样

结合态淀粉合成酶(GBSS)检测试剂盒 ; 100管/96样

测定意义： 

GBSS（EC 2.4.1.21 ）以束缚态存在于淀粉体中，催化淀粉链的加长反应，主要负责直链淀粉的合成。

测定原理： 

GBSS 催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应,将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成 ADP；进一步通过反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化 NADP+还原为 NADPH ，其中NADPH 生成量与前一步反应生成的ADP数量呈正比，通过 340nm 下测定 NADPH 的增加量，可以计算GBSS活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体100mL×2瓶，4℃保存；

试剂一：液体40mL×1瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入14mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入8mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1瓶，4℃保存；临用前加入10mL试剂一充分混匀备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂五：液体×1支，-20℃保存；临用前加入 500μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加入500μL蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

粗酶液制备：

称取 0.1~0.2g组织(建议称取约0.1g组织)，加入1mL提取液，冰浴中匀浆。10000g ，4℃离心10min ，弃上清，在沉淀中加入1mL提取液充分混匀，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在EP管中按顺序加入下列试剂

注 意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

GBSS活性计算：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按样本蛋白浓度计算：

      单位的定义：

      每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

      GBSS(nmol/min /mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T×稀释倍数=529×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质

      浓度。

2、按照样本鲜重计算：

      单位的定义：

      每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

      GBSS 活性（nmol/min /g鲜重）=[ΔA×V反总÷(ε×d)×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T×稀释倍数=529×ΔA÷WV 反总：反应体系总体

      积，2.6×10-⁴L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L/ mol/cm；d：比色皿光径,1cm；V 样：加入样本体积，0.75 mL；V 样

      总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL ；W：样本质量。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

1、按样本蛋白浓度计算：

      单位的定义：

      每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

      GBSS(nmol/min /mg prot)＝[ΔA×V反总÷(ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr)÷T×稀释倍数=1059×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质

      浓度。

2、按照样本鲜重计算：

      单位的定义：

      每g组织每分钟催化产生1nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

      GBSS 活性(nmol/min /g鲜重)=[ΔA×V反 总 ÷( ε×d )×10⁹]÷(W×V 样÷V 样 总)÷T×稀释倍数=1059×ΔA÷WV 反总：反应体系

      总体积，2.6×10-⁴L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075

      mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.9；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。