6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6PGDH)检测试剂盒/96样
测定意义：
6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-PGDH,EC 1.1.1.43)是磷酸戊糖途径中关键酶之一，在维持 细胞 NADPH 水平上起重要作用，与生物体能量平衡、生长速率和细胞活力等密切相关。本试剂盒提供一种简单，灵敏，快速的测定方法：6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶催化6-磷酸葡萄 糖酸和 NADP+生成 NADPH。进而与特异显色探针反应生成有色物质，通过检测该有色 物质的增加速率，计算出6-PGDH 酶活性大小。
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存要求 | 备注 |
提取液 | 液体100mL×1瓶 | 4℃保存 | |
试剂一 | 液体25mL×1瓶 | ④℃保存 | |
试剂二 | 粉剂mg×1瓶 | 4℃保存 | 用前甩几下使粉剂落入底部(量少，勿损失),再加17.5mL试剂一充分溶解，用不完的试剂4℃保存。 |
试剂三 | 液体1mL×EP管 | 4℃保存 | |
标准品 | 粉剂mg×1支 | -20℃保存 | 若重新做标曲，则用到该试剂 |
所需的仪器和用品：
酶标仪、96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、和蒸馏水。
6 -磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6 - PG DH)活性测定：
建议正式实验前选取2个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费!
1、样本制备：
① 组织样本：称取约0. 1g组织，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆。12000rpm4℃离心15min, 取上清，置冰上待测。上清，置冰上待测。
注: 若增加样本量，可按照组织质量 (g): 提取液体积(mL) 为1:5~10的比例提取。
② 液体样本：直接检测。若浑浊，离心后取上清检测。
2、上机检测：
① 酶标仪预热30min 以上，设置温度25℃,调节波长至450nm。
② 试剂解冻至室温(25℃);
③ 在 9 6 孔板中依次加入：
试剂名称(μL) | 测定管 |
样本 | 20 |
试剂一 | 170 |
试剂二 | 10 |
混匀，25°℃条件下，立即于450nm处读取Al值，20min后读取A2值，(观察：酶活性越大，则黄色越明显)。△A=A2-Al。 |
注 : 若△A 过小，可以延长反应时间(如：60min 或更长)再读取 A2, 或加大样本取样量(如增加到0.2g),重新调整的反应时间 T 需代入计算公式重新计算。
结果计算：
1、标准曲线方程：
y=0.0795x-0.0107,x 是NADPH摩尔质量(nmol),y是△A。
2、按蛋白浓度计算：
酶活定义：
每毫克蛋白每分钟催化产生1nmolNADPH 的酶量为1个酶活单位。
6PGDH(nmol/min/mgprot)=[(△A+0.0107)÷0.0795]÷(Cpr×V1)÷T=31.45×(△A+0.0107)÷Cpr。
3、按样本质量计算：
酶活定义：
每克组织每分钟催化产生1nmol NADPH 的酶量为1个酶活单位。
6PGDH 酶活性(nmol/min/g鲜重)=[(△A+0.0107)÷0.0795]÷(V1÷V×W)÷T=31.45×(△A+0.0107)÷W。
4、按细胞数量计算：
酶活定义：
每毫升液体每分钟催化产生1nmol NADPH的酶量为1个酶活单位。
6PGDH酶活性(nmol/min/mL)=[(△A+0.0107)÷0.0795]÷V1÷T=31.45×(△A+0.0107)V----加入提取液体积，1mL;V1----加入样本体积， 0.02mL;W----样本质量，g.----反应时间，20min;Cpr----样本蛋白质浓度，mg/mL; 建议使用本公司的 BCA 蛋白含量检测试剂盒。
附：标准曲线制作过程：
1、制备标准品母液(1nmol/μL):向标准品 EP 管里面加入0.6mL 蒸馏水(母液需在两天内用且-20℃保存)。
2、把母液稀释成六个浓度梯度的标准品：0,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5.nmol/μL。也可根据实际样本来调整标准品浓度。
3、按 照 2 0 μL 标准品+170 μL 试剂—+10 μL 试剂三，根据结果即可制作标准曲线。
