5'-核苷酸酶活性检测试剂盒 ; 50T/24S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
提取液 | 液体30mL×1瓶 | -20℃保存 |
试剂一 | 粉剂×2 支 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体12mL ×2瓶 | 4℃保存 |
试剂三 | 液体30 mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂四 | 液体25 mL×1瓶 | 4℃保存 |
试剂五 | 粉剂× 1瓶 | 4℃保存 |
试剂六 | 粉剂× 1瓶 | 4℃保存 |
试剂七 | 液体12mL×1瓶 | 常温保存 |
标准品 | 粉剂×1支 | 4℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂五： 临用前加入12 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂 4℃保存两周。
2、试剂六 ：临用前加入12 mL 蒸馏水，充分溶解，用不完的试剂 4℃保存两周。
3、工作液配制：临用前取1支试剂一中加入到1瓶试剂二中充分溶解；用不完的试剂-20℃分装保存一周 ，现用现配。
4、定磷试剂的配制 ：按 H2O ：试剂五：试剂六 ：试剂七 =2:1:1:1 的比例配制 ，配好的定磷试剂应为浅黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染（请根据需要，用多少配多少）。
5、标准品 ：8mg 磷标准品。临用前加入 4.6 mL 试剂四溶解配制成 10μmol/mL 的标准溶液 ，溶解后 4℃保存两周。
产品简介：
5'-核苷酸酶(5'-NT)是一种对底物特异性不高的水解酶 ，可作用于多种核苷酸。广泛存在于各种植物、动物组织、血清血浆中。 5'-NT 是一种特殊的磷酸酯水解酶 ， 它只作用于核苷-5'-磷酸如 AMP(腺苷-5'-磷酸或腺苷酸)生成无机磷酸和核苷。通过定磷显色法测定所生成的无机磷含量 ，可以计算出 5'-NT 的活性高低。
注意 ：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
天平、可见分光光度计、台式离心机、低温离心机、恒温水浴锅/恒温培养箱、 1 mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1、组织 ：按照质量（g)﹕提取液体积(mL)为1﹕5-10的比例（建议称取约 0.1 g ，加入1mL提取液)，冰上匀浆后于4℃,15000 g离心10 min ,取上清置于冰上待测。
2、细胞：按照细胞数量（10⁴个）﹕蒸馏水体积（mL)为 500-1000﹕ 1的比例（建议 500万个细胞加入1 mL 提取液)，冰浴超声波破碎细胞（功率 300 W ，超声 3 s ，间隔 7 s ，总时间 3 min）；然后 4℃ , 15000 g 离心 10 min ，取上清置于冰上待测。
3、血清 ：直接检测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热30 min 以上，调节波长至 660 nm，蒸馏水调零。
2、将标准品用试剂四稀释至 0.48、0.24、0.12、0.06、0.03、0.015 μmol/mL 标准液。
3、操作表（在 1.5 mL EP 管中操作）
试剂名称(μL） | 测定管 | 对照管 |
样本 | 100 | 100 |
工作液 | 400 | - |
漩涡混匀 ，37℃（哺乳动物）或 25℃（植物及其他）反应 30 min |
提取液 | 500 | 500 |
工作液 | - | 400 |
(2) 显色反应
试剂名称(μL) | 测定管 | 对照管 | 标准管 | 空白管 |
上清液 | 400 | 400 | - | - |
标准液 | - | - | 400 | - |
试剂四 | - | - | - | 400 |
定磷试剂 | 800 | 800 | 800 | 800 |
漩涡混匀,40℃显色 10 min；取1mL反应液于1mL玻璃比色皿中,在 660nm下测定吸光值 A，分别记为 A 测定、A 对照、A 标准、A 空白 ，计算 ΔA 标准 =A 标准-A 空白 ，ΔA 测定 =A 测定-A对照（空白管只需测定 1-2 次）。 |
三、5.-NT 活性计算
1、 标准曲线的建立：
以各个标准溶液的浓度为 x 轴，其对应的ΔA 标准为 y轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y = kx+b，将ΔA 带入方程得到 x (μmol/mL）。
2、5.-NT 活性的计算
(1) 按样本蛋白浓度计算：
酶活单位定义：
每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT 酶活（ U/mg prot） =x×V 反总÷ (V 样 ×Cpr) ÷T × 10³ =333.3 ×x÷Cpr
(2) 按样本质量计算：
酶活单位定义：
每克组织在反应体系中每分钟产生1 nmol 无机磷定义为一个酶活单位。
5'-NT 酶活(U/g 质量)=x×V 反总÷(W ×V 样 ÷V 样总)÷T× 10³=333.3×x÷W
(3) 按细胞数计算：
酶活单位定义：
每 10⁴个细胞在反应体系中每分钟产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT 酶活( U/10⁴cell)=x×V 反总÷ (细胞数量 ×V 样÷V 样总)÷T × 10³ =333.3 ×x÷细胞数量
(4) 按液体体积计算：
酶活单位定义：
每毫升液体在反应体系中每分钟产生 1nmol 无机磷定义为一个酶活性单位。
5'-NT 酶活(U/mL) =x×V 反总÷V 样÷T × 10³ =333.3 ×xV 样：酶促反应中加入样本体积 ，0.1 mL；V 反总：酶促反应总体积 ,1mL；V样总： 加入提取液的体积 ,1mL；W：样本质量 ，g；Cpr：样本蛋白浓度,mg/mL；细胞数量：以万计；T：酶促反应时间,30min； 10³ ：单位换算, 1μmol =10³nmol。
注意事项：
ΔA 测定大于1或者 A 测定管大于1时 ，建议将样本用试剂四稀释后再进行测定。
实验实例：
1、取 0.1g 小鼠肝，进行样本处理，取上清后按照测定步骤操作，测得计算ΔA 测定管 =A 测定-A 对照 =0.723-0.534 =0.189 ，带入标准曲线 y =2.3928x+0.0165 ，计算 x =0.0721 ，按照样本质量计算酶活得：5'-NT 酶活（ U/g 质量） =333.3 ×x÷W =333.3 ×0.0721÷0.1 =240.31 U/g 质量。
2、取 0.1g 稗草 ，进行样本处理 ，取上清后按照测定步骤操作 ，测得计算ΔA 测定管 =A 测定-A 对照 =0.367-0.281 =0.086，带入标准曲线 y =2.3928x+0.0165，计算 x =0.0290，按照样本质量计算酶活得：5'-NT 酶活（ U/g 质量） =333.3 ×x÷W =333.3 ×0.0290÷0.1 =96.657 U/g 质量。
