辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)含量检测试剂盒 ; 50T/24样
测定原理:
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和NADPH。NADPH 通过PMS的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm下检测吸光值,从而测定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为NADPH,从而检测NADP+含量。
仪器设备(自备):
可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1ml 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成:(50T/24样):
酸性提取液:50ml ×1瓶,4℃保存;
碱性提取液:50ml ×1瓶,4℃保存;
试剂一:液体15 ml ×1瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1支,-20 ℃保存,用时加入4ml 蒸馏水,混匀;用不完的试剂4℃保存一周;
试剂三:粉剂×1支,-20℃保存,用时加入4ml蒸馏水,混匀;用不完的试剂4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1支,4℃保存,用时加入4ml蒸馏水,混匀;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体1.8ml×1支,4℃保存;
试剂六:液体30ml×1瓶,4℃保存;
试剂七:液体50ml×1瓶,4℃保存。
操作步骤:
(一)NADP+和NADPH的提取:
详见试剂盒内说明书关于样本处理的说明。测定组织、细菌和细胞时需要测定蛋白浓度。可用总蛋白定量测试盒(考马斯亮蓝法)或者总蛋白定量测试盒(BCA 法)进行蛋白浓度的测定。
(二)测定步骤:(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加样,反应过程需要避光):
试剂名称(μl)
对照管
测定管
样本
50
试剂一
250
试剂二
75
试剂三
试剂四
试剂五
35
试剂六
混匀,室温避光静置20min
500
试剂七
1000
充分混匀 ,静置5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:混匀,波长 570nm,
光径 1cm,双蒸水调零测定对照吸光值A1和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。
注:对照管试剂五加完后必须马上加入试剂六,而测定管加完试剂五之后必须反应20min 后再加试剂六。