Caspase-5活性检测试剂盒/100T
试剂盒组成和配制：
试剂名称/规格 | 20T | 50T | 100T | 保存条件 |
试剂一 | 液体20mL×1瓶 | 液体20mL×1瓶 | 液体25mL×1瓶 | -20℃保存 |
试剂二 | 液体30mL×1瓶 | 液体60mL×1瓶 | 液体120mL×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体0.25L×1支 | 液体0.55mL×1支 | 液体0.55mL×1支 | -20℃保存 |
标准品 | 液体1mL×1支 | 液体1mL×1支 | 液体1mL×1支 | -20℃保存 |
溶液的配制：
1、试剂一：分装-20℃保存。
2、试剂二：分装-20℃保存。
3、标准液： pNA 标准溶液，5mmol/L。标准溶液在 4℃条件下为浑浊状态 ，溶解即可变为澄清状态,不影响使用。
4、标准品稀释液配制： 取9 mL试剂一加入 1mL 试剂二 ，充分混匀待用。（也可按照试剂一：试剂二 =9:1 的比例,自行配制）
产品说明：
Caspase 是参与细胞凋亡过程的蛋白酶家族,包含 10 多个成员.Caspase-5分子量47.7kD,与ICE有51%的同源性，在过量表达时可诱导凋亡发生。Caspase-5特异水解其多肽底物N-acetyl-Trp-Glu-His-Asp-p-nitroanilide(Ac-WEHD-pNA)，释放出游离的硝基苯胺pNA，后者呈黄色在405 nm具有大吸收峰，采用可见光光度比色法进行测定 ，吸光度值对应于 Caspase-5 的水解活性。
注意：实验之前建议选择2-3个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者 增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、100μL玻璃比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅/恒温培养箱、可调式移液器、研 钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
一、样本处理(可适当调整待测样本量)
1、培养细胞： 先收集细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细胞数量（约 10⁶个） 加 100μL 试剂二（若裂 解不充分可提高至150-200μL)，震荡重悬沉淀，置冰上静置15 min，4℃ , 15000g离心10- 15min,取上清置冰上待测。
2、组织： 按照组织质量（g）：试剂二体积（mL）为1： 5~10的比例（建议称取约 0.1 g 组织，加入1 mL 试 剂二），冰浴研磨或充分剪碎，置冰上静置15 min，4℃ , 15000g离心10- 15min，取上清置冰上待测。
二、测定步骤
1、可见分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长至405 nm ，蒸馏水调零。
2、临用前用标准品稀释液将5mmol/L pNA 标准品稀释至 200、100、50、25、12.5、0μmol/L 的标准溶液待用。
3、样本测定（在 96 孔板/EP 管中按顺序加入以下试剂）
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 | 标准管 |
试剂一 | 40 | 40 | |
样本 | 50 | | |
试剂二 | | 50 | |
试剂三 | 10 | 10 | |
标准溶液 | | | 100 |
混匀,盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。37℃孵育60- 120分钟。发现颜色变化比较明显时即可测定 405nm 处吸光值。如果颜色变化不明显,可以 适当延长孵育时间,甚至可以孵育过夜,空白管只需做1-2 次。计算 ΔA 测 定 =A 测定管-A 空白管。 | 立即测定405nm下吸光度 |
三、Caspase-5活性计算
1、标准曲线的建立：
根据标准管的浓度（x,μmol/L）和吸光度（y，减去浓度为0的空白管）做标准方程。将ΔA测定代入标准 方程得到 x( μmol/L）。
2、按酶活性增加百分比计算
Caspase- 5活性增加百分比 =（实验处理组 A 测定-A 空白管）/(实验对照组A 测定-A空白管) × 100%该方法简单可靠 ，可粗略反应酶活性情况。
3、按酶活计算
参考Chemicon 公司的 caspase 酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will cleave 1.0 nmol of the colori metric pNA-substrateperhour at 37℃under saturated substrate concentrations。即一个酶活力单位定义为当底 物饱和时 ,在 37℃一个小时内可 以剪切1nmolpNA底物产生1nmol游离pNA的酶量。这样就可以计算出样品中含有多少个酶活力单位的 caspase 酶活性。Caspase-5活性 (U/mgprot)=x×V 反总÷（V样×Cpr)÷T ×10³ =2x÷Cpr÷TV 反总：反应体系总体积，0.1mL=10¯⁴L；V 样：加入的样本体积,0.05mL；T：反应 时间,h ；Cpr：样本蛋白质浓度,mg/mL；10³ ：单位换算系数 ,1μmol =10³nmol。
注意事项：
1、由于试剂二一中含有还原剂（ DTT），建议将样品用水稀释2倍后 ，用 Bradford 法测定蛋白浓度,以降低 DTT 对蛋白浓度测定的干扰。不建议使用BCA法测定蛋白浓度。
2、Caspase 活性测定值低常见的原因是细胞未发生凋亡或细胞量太少 ，其次是观测时间不恰当。诱导凋亡时 ，并非剂量越大时间越长 Caspase 活性就越高。建议设置不同剂量和时间点如 0、 2 、4 、8 、 16、24 小时 ，以检测佳的观察点。
3、所测样本的值高于标准曲线上限时 ，可用试剂二稀释样本后重新测定。
4、盖紧 96 孔板盖子并用封口膜密封。 37ºC 孵育，肉眼可见颜色变黄时的 OD405 值约为 0.2，此时即可测定。颜色变化不明显可延长反应或过夜，但酶活性较强时，孵育时间过长将导致反应失去线性关系。
