丁酰胆碱酯酶(BchE)活性检测试剂盒 ; 50T/48S
试剂盒组成和配制：
试剂名称 | 规格 | 保存条件 |
试剂一 | 液体100 mL×1瓶 | 2-8℃保存 |
试剂二 | 粉剂×1瓶 | -20℃保存 |
试剂三 | 液体30mL× 1瓶 | -20℃保存 |
溶液的配制：
试剂二： 临用前加入 30mL 试剂一 ，充分溶解 ， -20℃分装保存 4 周 ，避免反复冻融。
产品说明：
丁酰胆碱酯酶(Butyrylcholinesterase， BchE， EC3.1.1.8)，又称血浆胆碱酯酶 ，假性胆碱酯酶 ，是一种丝氨酸水解酶 ， 由肝脏合成后进入血液 ，几乎存在于所有动物组织中。 BchE结构与乙酰胆碱酯酶(AchE)相似，但底物特异性和抑制剂敏感性不同。与 AchE 相比，BchE能够有效水解较大的胆碱酯，如丁酰胆碱和苯甲酰胆碱，而且可以清除有机磷类农药、氨基甲酸酯类农药等神经毒剂的毒害作用。有研究表明 ， BchE 可作为阿尔茨海默病治疗的重要靶点。 BchE 催化丁酰胆碱水解生成胆碱 ，胆碱与二硫对硝基苯甲酸(DTNB)作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸(TNB)；TNB 在 412nm 处有吸收峰，通过测定 412nm 吸光度增加速率，计算 BchE 活性。
注意： 实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计、低温离心机、分析天平、水浴锅/恒温培养箱、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量）
1、组织样本：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL) =1：5~10 比例加入试剂一(建议称取 0.1g样本 ，加入 1.0mL 试剂一) ，冰浴匀浆后 ，于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
2、血清/血浆等液体样本 ：直接测定。若有浑浊请离心后取上清置于冰上待测。
3、细菌、细胞 ：按照细胞数量 104 个 ：试剂一体积(mL)500 ~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3s，间隔 7s，总时间 3min)，于 4℃,12000rpm 离心 10min ，弃沉淀 ，取上清液置于冰上待测。
二、测定步骤
1、分光光度计预热 30min 以上 ，调节波长至 412nm ，蒸馏水调零。
2、操作表： (在 1mL 玻璃比色皿中加入下列试剂)
试剂名称(μL) | 测定管 | 空白管 |
样本 | 50 | - |
蒸馏水 | - | 50 |
试剂二 | 500 | 500 |
试剂三 | 500 | 500 |
立即充分混匀后于 412nm 处测定 10s 时的吸光值 A1 ，迅速置于 37℃水浴或恒温培养箱 5min,拿出迅速擦干测定 5min10s 时的吸光值 A2。计算ΔA 测定 =A 测定 2-A测定 1，ΔA空白=A空白2-A空白1,ΔA =ΔA测定-ΔA 空白。空白管只需测定1-2次。 |
三、BchE活性计算
1、按照样本蛋白浓度计算
活性单位定义：
每 mg 蛋白每分钟催化产生1nmolTNB 为1个酶活单位
BchE 活性(U/mgprot) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总 × 10⁹]÷ (Cpr×V 样)÷T × F =308.8 ×ΔA÷Cpr×F。
2、按照样本质量计算
活性单位定义：
每g组织每分钟催化产生1nmolTNB为 1个酶活单位。
BchE 活性(U/g质量) =[ΔA÷(ε×d) ×V 反总 × 10⁹]÷ (W ×V 样÷V 样总)÷T × F =308.8 ×ΔA÷W× F。
3、按照血清/血浆等液体体积计算
活性单位定义：
每 mL 血清/血浆每分钟催化产生 1nmolTNB 为 1 个酶活单位。
BchE 活性(U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V反总 ×10⁹]÷V 样÷T× F =308.8 ×ΔA × F。
4、按照细胞/细菌数量计算：
蛋活性单位定义：
每万个细胞每分钟催化产生1nmolTNB 为1个酶活单位。
BchE 活性(U/10⁴cell) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总× 10⁹]÷ (N ×V 样÷V 样总)÷T × F =308.8 ×ΔA÷N × F。ε ：TNB 摩尔消光系数,13.6 × 10³L/mol/cm;d： 比色皿光径， 1cm； V 反总 ：反应体系总体积,1.05mL =1.05 ×10³L；10⁹：单位换算系数,1mol =1 × 10⁹nmol；V 样：反 应体系加入样本体积 ，0.05mL；V 样总 ：加入试剂一体积 ,1mL；Cpr：蛋白浓度,mg/mL；W：样本质量 ,g；T：反应时间 ,5min； F：样本稀 释倍数;N ：细菌/细胞数量,以万计。
注意事项：
1、为保证结果准确 ，请严格控制反应时间 ，建议两人进行实验 ，一人加样 ，一人计时。如果∆A 测定接近∆A 空白，可以增加样本量后再进行测定；如果 A2 测定大于 1 或ΔA 测定大于 0.7 ，建议将样本上清用试剂一适当稀释后再进行测定。注意同步修改计算公式。
实验实例：
2、取 0.1018g 大鼠肝脏样本 ，加入1mL 试剂一进行冰浴匀浆 ，离心后上清液用试剂一稀释 4 倍 ，按照测定步骤操作 ，用1mL玻璃比色皿测得计算 ：ΔA 测定 =A 测定 2-A 测定1 =0.6807-0.3913 =0.2894，ΔA 空白 =A 空白 2-A 空白 1 =0.3552-0.2931 =0.0621，ΔA = ΔA 测定-ΔA 空白 =0.2273 ，按样本质量计算得： BchE 活性(U/g 质量) =[ΔA÷(ε×d) ×V 反总 × 10⁹]÷ (W ×V 样÷V 样总)÷T × F =2757.966U/g 质量。
3、取马血清样本，用试剂一稀释64倍，按照测定步骤操作，用 1mL 玻璃比色皿测得计算： ΔA测定=A测定2-A测定1 =0.5100-0.3436 =0.1664，ΔA空白=A空白2-A空白1 =0.3552-0.2931 =0.0621，ΔA =ΔA 测定-ΔA 空白 =0.1043，按液体体积计算得： BchE活性(U/mL) =[ΔA÷(ε×d)×V 反总× 10⁹]÷V 样÷T× F =2061.302U/mL。
