试剂盒组成及配制：
| 组份 | 48T | 96T | 保存 |
试剂一 | 基质缓冲液 | 3ml×1瓶 | 5ml×1瓶 | 2～8℃保存 |
试剂二 | 辅酶Ⅰ | 粉剂×1支 | 粉剂×1支 | -20℃冷冻保存 |
| 辅酶Ⅰ溶液配制：每支粉剂加1.3ml双蒸水溶解，溶解后冷冻可保存2 周，如需多次使用建议分装冷冻（防止反复冻融） |
试剂三 | 2，4-二硝基苯肼 | 3ml×1瓶 | 5ml×1瓶 | 2～8℃避光保存 |
试剂四 | 4mol/LNaOH | 3ml×1瓶 | 5ml×1瓶 | 2～8℃保存 |
0.4mol/LNaOH溶液配制：将4mol/LNaOH溶液用双蒸水10倍稀释，需多少配多少 |
试剂五 | 2μmol/ml丙酮酸标准液 | 1ml×1支 | 1ml×1支 | 2～8℃保存 |
0.2μmol/ml 丙酮酸标准应用液配制：取2μmol/ml 丙酮酸标准液用双蒸水10倍稀释，现用现配 |
样本采集及保存：
1、本试剂盒适用于检测动物血清、组织、灌流液、细胞培养液等中乳酸脱氢酶(LDH)的活力。
2、按常规采集样本，样本可以是血清、血浆（肝素抗凝为佳）、细胞培养上清。组织或细胞（按实验方法学的样本前处理）。
3、如不能及时检测，请将样本放置于-20℃以下保存。
4、测定前的样本前处理需参照实验方法学。
测定步骤：
| 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
双蒸水(µl) | 25 | 5 | | 5 |
0.2μmol/ml丙酮酸标准液(µl) | | 20 | | |
待测样本(µl) | | | 20 | 20 |
基质缓冲液(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
辅酶Ⅰ(µl) | | | 5 | |
混匀，37℃温浴 5分钟 |
2 ，4-二硝基苯肼(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
混匀，37℃温浴 15分钟 |
0.4mol/L NaOH溶液(µl) | 250 | 250 | 250 | 250 |
混匀，室温放置5分钟，波长450nm，酶标仪测定吸光度值。 |
*参考取样量：0.01%小鼠脑组织匀浆取 5～20µl（根据样本活力高低确定取样量），人血清10倍稀释取10~ 30µl（根据样本活力高低确定取样量）。若样本中LDH酶活力太高，可将样本用生理盐水稀释后再测。具体摸索方法见附录。
注：1、对照孔中不加辅酶 I。
2、严格按照说明书操作，不可先加辅酶I 再加基质液。
测定原理
注意点：
1、由于加样量比较少，
建议：
① 加样时左手稳住加样枪；
② 将吸头靠近酶标孔底部，缓慢加样，边加边将吸头上移，以保证吸头上样本残留量最少；
③ 如有秤盘式离心机，可缓慢离心数分钟，以保证样本及试剂聚集至酶标孔底部，以减少误差。
2、加试剂时需要注意，速度不宜太快，以免溅出酶标孔。
3、酶标孔比较小，所以混匀力度要适中，使用摇床或手动混匀时，动作不宜太过剧烈，以免液体溅出，太慢则混匀不充分；先将孔壁上的液体轻轻的震动落下，再前后、左右的摇动。
4、酶标板可能存在初始吸光度的差异，最好在使用前先在相应的波长处测定其初始吸光度，记录下差异，然后再加样测定。
5、辅酶 I 加样量比较少，所以最好加入时将吸头在反应液中反复吸打几次，并注意更换吸头。
6、加样时要尽量避免产生气泡。倘若有气泡，须将气泡破碎后再进行测定。
7、本试剂盒仅用于科研、实验室。
1、前处理：
将2µmol/ml的丙酮酸标准品用双蒸水分别 200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍稀释后按照操作表制作标准曲线。
2、操作表：
| 空白孔 | 标准孔 |
双蒸水(µl) | 25 | 5 |
不同浓度丙酮酸标准液(µl) | | 20 |
基质缓冲液(µl) | 25 | 25 |
混匀，37℃温浴15 分钟 |
2-4-二硝基苯肼(µl) | 25 | 25 |
混匀，37℃温浴15 分钟 |
0.4mol/l 氢氧化钠溶液(µl) | 250 | 250 |
混匀，室温静置 5 分钟，波长 450nm，酶标仪测定吸光度值。 |
3、绘图如下：
附录Ⅱ：大鼠血浆LDH取样浓度摸索
1、试剂及配制：由上海酶联生物科技有限公司提供并按说明书配制。
2、样本来源：以本所大鼠血浆为例，进行LDH检测最佳取样浓度摸索。
3、操作表：（将原大鼠血浆浓度视为1，则100倍稀释后浓度视为0.01，以此类推其他相应浓度）
| 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
双蒸水(µl) | 25 | 5 | | 5 |
0.2 μmol/ml 丙酮酸标准液(µl) | | 20 | | |
待测样本(µl) | | | 20 | 20 |
基质缓冲液(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
辅酶 Ⅰ(µl) | | | 5 | |
混匀，37℃温浴15分钟 |
2 ，4-二硝基苯肼(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
混匀，37℃温浴15 分钟 |
0 4mol/LNaOH溶液(µl) | 250 | 250 | 250 | 250 |
混匀，室温放置5分钟，波450nm，酶标仪测定吸光度。 |
4、测定结果：
稀释倍数 | 空白 | 100倍 | 50倍 | 20倍 | 10倍 | 5倍 |
测定OD | 0.0589 | 0.2799 | 0.3973 | 0.5795 | 0.6929 | 0.7427 |
对照OD | 0.0589 | 0.0613 | 0.0667 | 0.0851 | 0.1064 | 0.1509 |
绝对OD值 | 0.0000 | 0.2186 | 0.3306 | 0.4944 | 0.1064 | 0.5918 |
参考取样浓度：大鼠血浆为50～100倍稀释，最佳取样量为20μl。在其范围内酶曲线通过回归曲线的处理，相对成正比关系。（若稀释浓度过大或过少，则在实验结束后，在进行统计学处理时会出现无显著差异）
附录Ⅲ：大鼠肾匀浆LDH取样浓度摸索
1、试剂及配制：由上海酶联生物科技有限公司提供并按说明书配制。
2、样本来源：正常组大鼠肾组织
3、前处理：
大鼠肾组织取出后用生理盐水制成10%的匀浆上清液（具体见实验方法学），用生理盐水10倍稀释成1%
后再用生理盐水分别稀释成不同的浓度：0.01% 、0.02% 、0.05% 、0.1% 、0.2% 、0.5%。同时用 0.5%的肾组织匀浆液用于蛋白定量（考马斯亮蓝法测定蛋白，本所有售）。
4、操作表：
| 空白孔 | 标准孔 | 测定孔 | 对照孔 |
双蒸水(µl) | 25 | 5 | | 5 |
0.2μmol/ml丙酮酸标准液(µl) | | 20 | | |
待测样本(µl) | | | 20 | 20 |
基质缓冲液(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
辅酶Ⅰ(µl) | | | 5 | |
混匀，37℃温浴15分钟 |
2 ，4-二硝基苯肼(µl) | 25 | 25 | 25 | 25 |
混匀，37℃温浴15 分钟 |
0 4mol/LNaOH溶液(µl) | 250 | 250 | 250 | 250 |
混匀，室温放置5分钟，波450nm，酶标仪测定吸光度。 |
5、结果：
样本浓度 | 空白 | 0.01% | 0.02% | 0.05% | 0.1% | 0.2% | 0.5% | 1% |
测定OD | 0.0588 | 0.1653 | 0.2807 | 0.4473 | 0.6187 | 0.6979 | 0.8065 | 0.9133 |
对照OD | 0.0588 | 0.0594 | 0.0636 | 0.0833 | 0.0930 | 0.1340 | 0.2120 | 0.2835 |
绝对OD值 | 0.0000 | 0.1059 | 0.2171 | 0.3641 | 0.5257 | 0.5639 | 0.5945 | 0.6298 |
由以上曲线可见绝对吸光度OD 值介于0.05～0.50之间呈线性相关，最佳绝对吸光度在控制在0.2～0.4之间，根据您实验中的具体情况来选择最佳取样浓度
